Способ маркирования 11-й хромосомы человека,рекомбинантная плазмидная днк @ 53 для маркирования,фрагмент геномной днк @ 53 для маркирования и способ получения фрагмента днк @ 53

 

1. Способ маркирования 11-й хромосомы человека, включаюй ий приготовление препаратов метафазных хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека, денатурацию хромосомной ДНК, радиоактивное мечение рекомбинатной ДНК pHS 53 OAATCTGCAAGTGGATATTTGGACTTCICTGAGGATTTCGTTGGAAACGGGATflAACTTCCCAGAACTACACGGA AGCATTGTGACAAACTTCTTTGTGATijTTTGCATTCftACTCACAGAGTTOAACCTTGCTTTCATAGTTCAGCTTTCAAAC ACTCTTTTTGTAGAATCTGCAAGTGGATATTTOGACCACTTTGTGGCCTTCCTTCGAAACGfjQTATATCTTCACATCAAA CCTAGACCGAAGCATTCTCAGAATGTTTCCTTTGATGACTGCATTCAACTCACAGAGGTOAACAATCCTGCTGATGGAOC AOTTTTGAAACTCTCTTTCTTTGGftTTCTGCAAGTGGATATOTGGACCTCTGTGAAGATTTCTTTOGAAACGGGTTCATC TTCACAGAAAAACTAAACAGAAOCATTCTCAGAAACTGCTTTGTGAfGTTTGTGTTCCACTTCAGDAATTAAACTTTCCT CTTGACAGAGCAGCTCTGAAACCCTC9TATTCTAGAATCTGCAAGTGGArATTTGGAGGACTTTGAGGCCTGTr,GTGGAA AAGGAAAATCTTCACATAAAAACTAGAIGGAAGCATTCTCAGAAACTACTTTGTOAIGATTGCATTCGACTCACAGAGTT тритием путем реакции нуклеотидного замещения, денатурацию меченой рекомбинатной ДНК, молекулярную гибридизацию меченой ДНК с ДНК метафазных хромосом, промывку препаратов, радиоавтографическое проявление меченого гибридизованного фрагмента на хромосомах с последующим их ок рашиванием. 2. Рекомбииантная плазмидная ДНК pHS 53 для специфического маркирования прицентромерного района 11-й хромосомы человека, резмером 12500 пар нуклеотидов, состоящая из: большого Pstl-фрагмента векторной плазмиды pKNool размером 10000 пар нуклеот1адов, несущего ген устойчивости к тетрациклину, которьм представляет собой часть бактериальной плазь5иды Со Е i и ограничен участками расщепления рестриктазами EcoRl и Ира 1, и последовательность ДНК фага Ми, обуславливающую лизис чувствительных клеток, ограниченную двуця участками расщепления рестриктазой EcoRl; Pstl-фрагмента геномной ДНК из лимфоцитов человека, 3. Фрагмент геномной ДНК pHS 53 из лимфоцитов человека, включающий повторяющуюся последовательность альфоидной ДНК, длиной 2546 пар нуклеотидов с последовательностью (Л ro о 00 00

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ 1203108

А (5И 4 С 12 М 15/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ оддтстосддотосдтдтттссдсттст стсдоодтттсаттоадмсссодтдмсттсссдоддстдсдсосд е досдттотодсмдсттстттотадтотттосдттсмсTcAcAGAGTòGAAññòòññòòтсдтдоттсдостттсдддс

AcTcTTTTTGTAG4ATcTGcA4GTоо4тдтттоодссдстттстооссттссттсодмсгоотдTATcTTcAc4TcAAA сстдсдссомосдттстсдоддтотттсстттодтодстосдттсмстсдсдодаотомсмтсстостодтоодас даттттодддстстстттстттосдттстосддстссдтдтотоодсстстотсддадтттстттоодддсссаттсдтс ттсдсдодддддстдмсдомосдттстсдомдстостттстсд готттатоттссдсттсдссддттдддстттсст

CTTG4CAGAGCAGCTCTGAAACCCTCPTATTCTAGA4TCTGCA4GTGGAГ4TTTGGAGG4CTTTGAGGCCTGTGGTGG4A

A4GGAAAATCTTCACAT44AAACTAG4TGGAAGCATTCTCAGA44CTACòòòGòGAòодттосдттсодстсдсдсдотт (21) 3778107/28-14 (22) 02.08,84 (46) 07.01.86. Бюл. Ф 1 (71) Институт клинической психиат— рии Всесоюзного научного центра психического здоровья АМН СССР (72) В.М. Гиндилис, И.3 ° Зайцев, А,Г. Яковлев, Ю.Б.Юров и Ю,А. Шапиро (53) 575.113(088,8) (56) Jeanpierre M., Neil D. et al,, Organization of à human tandemly

repeated DNA is chromosome-specific.Cytogenet.Cell Genet., 1984, v.37, Р:1-4, р.242.

Gosden J.R., Lawrie S.S., Cooke Н ° J., А cloned repeated DNA

sequense in human chromosome Ñótogenet. Cell Genet., 1981, v.29, М 1, р.32. (54) СПОСОБ МАРКИРОВАНИЯ 11-й XPOMOCOMb ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHS 53 ДЛЯ МАРКИРОВАНИЯ, ФРАГМЕНТ ГЕНОМНОЙ ДНК pHS 53 ДЛЯ МАР—

КИРОВАНИЯ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАГМЕНТА ДНК pHS 53. (57) 1. Способ маркирования 11-й хромосомы человека, включающий приготовление препаратов метафазных хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека, денатурацию хромосомной ДНК, радиоактивное мечение рекомбинатной ДНК pHS 53 тритием путем реакции нуклеотидного замещения, денатурацию меченой рекомбинатной ДНК, молекулярную гибридизацию меченой ДНК с ДНК метафазных хромосом, промывку препаратов, радиоавтографическое проявление меченого гибридизованного фрагмента на хромосомах с последующим их ок" рашиванием.

2. Рекомбипантная плазмидная ДНК

pHS 53 для специфического маркирования прицентромерного района 11-й хромосомы человека, резмером

12500 пар нуклеотидов, состоящая из: большого Pstl -фрагмента векторной плазмиды pKNool размером 10000 пар нуклеотидов, несущего ген устойчивости к тетрациклину, который представляет собой часть бактериальной плазмиды Со1Е1 и ограничен участками расщепления рестриктазами EcoR1 и Нра 1, и последовательность ДНК фага Ми, обуславливающую лизис чувствительных клеток, ограниченную двумя участками расщепления рестриктазой EcoR1;

Pstl-фрагмента геномной ДНК из лимфоцитов человека.

3. Фрагмент геномной ДНК рНЗ 53 из лимшоцитов человека, включающий повторяющуюся последовательность альфоидной ДНК, длиной 2546 пар нуклеотидов с последовательностью

1203108

64АСАТТССТАТАБАТАвАвсабвТТ6ТА44СААТСТТТТТОТ4644TCTGCGATTGGAGATTTGGACTGCTTTGAGGCC

TACTGTA6TAAA66AAATAACт TCATCтм4мссмас66м6сАттсАсА6Асмттстта6т0АтмттвсАтт6Ат

С1 AACAGAGCTGAACATTCCTTTAGATGGC6TAGTTTCCAAACACACTTTCTOTAGAATCTGCR46ò66àò4òòò664ñò

TCTCTG4GGATTTCGTTGGAAAC6GGATRAACTTCCCAGAACTACACOOAAGсАтт6тва6Амсттсттт6т0ат6ттт всаттсаастсасававттвмссттвстттсатавттсабстттсмасастстттттбтввмтствсаабтбватат ттввассастттвтввссттссттсвмасвввтататсттсасатсмасc TAGAccOARGcATTc TcRGARTOTTTcc

T6T6RcGAcTGc4TTc44cTcAc46A6Aт6ААсмтсствст6атгвА6сА6ттттвмАстстстттстттв6Аттсто

CRAGTTGATATGT66ACCTCTGTGAAGRTTTCGTT66AAACGGOTTCАТСТТСАС40АААААСТА4АС46446СЛТТСТС

AGAAACTGCTTTGTGAT6TTTGTGTTCCACTTCAAGAATTGAACTTTCCTCTTвасАва6са6стгт0мАссстстттт

ТСТАбРАТСТбСААВТ66АСАТТТббАбббСТТТ6466ССТОТбвТОС44ААО6АА44ТСТТСАСАТА4АААСТАОАТОО

RR6CATTcTCA6AAACT4CTTT6TG4TG4TT6CRTTCG4CTCRCR6RGTTOA4C4TTсстАТа6ата6А6сА06тт0тЛА

Асаатс тттт тбтаваатствсват твбават т тббастбстт тбаввсстаствтавтмаовааатмсттсатстаа

4RTCCR4ACGGAAGCATTCACAG4C44TTCTTAGT6ATAATTGCATT6ÀÒÑÒÀÀÑÀ6À6ÑÒ6ÀÀÑ4ÒÒÑÑÒÒÒÀ6ÀÒ66Ñ бтавтттссамсасастттстставаатствсмвтввататттббасттстствабватттсвттввааасввватаа

ACTTCCCA6AACTACACGGA46CATTGTGAG4AACT TCTTTGT64TGTTT6ñAòòñìñòñ4ñàOà6òò6ìññòò6ñòò тсатавттсабстттсааасас тсттт ттбтввмтствсмвтвватаT T TGGAccAc T T To 700cc T Tcc T TcGAAAc вввтататсттсасатсааасставасабаавсаттстсабаатвтттсствтбасваствсаттсаастсасававвтб мсаассствстватввАGCAGTTTTGAARCTTTCTTTGGATTCTGCAAGTвбататбтввасстствтвааватттсвт

TGGRRRCOGTTTCATCTTCACAGAAAAACTAARCAGGAGCATTCTC4GA4AСTGCTTTGTGATGTTTGTGTTCCACTTCA

RGARттGAACTTTCCTCTTGACA6AGCAGCTCTGAA4CCCTCTTTттстА6аатст6см0т60АсАттт66аб06сттт

GRGGCCTGTGGTGGAAAAGGAAAATCTTCAC4TAAAAACTAGATGGAAGCATTCTCA6ARACTACTTEGTGATGATTGC4

TTC6RCTCAC4GAGTTGAAC4TTCCTRTAGATAGAGCA6GTTGTAAACAATGттттт6тА6мтствсбАтт66А6Аттт вбастбстттваввсстаствтавт Амбвамтмсттсатстаммссмасввмвсаттсасабасааттсттав тбатсаттвваттбмстмсававстбмсаттсст т табатвг46446 TT Tccамсасастттствса генома человека. имеюций тандемную,организацию в геноме и кластеризованную локализацию в прицентромерном районе Il é хромосомы человека и не участвующий в синтезе белка, для специфического маркирования 11-й хромосомы человека, Способ получения фрагмента

ДНК pHS 53, включающий эндонуклеазный гидролиз геномной ДНК из лимфоцитов человека рестриктазой Р661, лигирование полученных рестриктных

Изобретение относится к медицинской генетике, в частности к области конструирования молекулярно-генетических маркеров, и может быть использовано для достоверной идентификации индивидуальных хромосом че— ловека в норме и патологии, включая пренатальную диагностику, а также для цитогенетического картирования

Изобретение не имеет аналогов, так как предлагаемьй способ.маркирования 11-й хромосомы человека разработан впервые.

Пелью изобретения является создание молекулярно-генетического фрагментов в участке узнавания для рестриктазы Pstl бактериальной плазмиды pKNool генетическую трансформапию клеток E.coli HE 101 рекомбинантной ДНК, селекцию рекомбинантных клонов, содержащих фрагменты альфоидной ДНК., по результатам гибридизации на колониях и идентификацию маркерного фрагмента путем молекулярной гибридизации на метафазных хромосомах человека в цитологических препаратах in situ. маркера 11-й хромосомы человека.

Сущность изобретения заключается в том, что клонированный фрагмент

ДНК рН 53 из лимфоцитов человека, представляющий собой повторяющуюся последовательность альфоидной ДНК человека, используется в качестве спепифического молекулярного маркера

11-й хромосомы человека. Данный фрагмент имеет длину 2546. пар нуклеотидов и состоит из 15 альфоидных мономеров (длиной !б7-171 н.п.каждый), расположеннь х тендемно, т ° е. по типу 3 -конец предыдущего мономе-! ра к 5 - концу последующего мономера.

Нолпый нуклеотидный текст фрагмента рНБ 53 следующий:

3 1 Z 11 I l ob

4 аадтстосадатоодтдтттсодсттс1стаааадтттсstтаоддасааоатяадсттсссааяястасасосд досаттстояодадсттсTYTGTGatstттбсдттса41:тсдсдаабттаддссттбстттсатаоттсаастттсаяяс

АстстттттатябА4тстасА461664тАтттааясс4стттстоогсттссттс64ААсбббтАтАтгттсАС4тсАЯА

CCTAGACCGAAGCATTCTCAG44TGTTTCCTTTGATGaCTGCATTCAACTcACAGAQQTGAACAATCCTQCTGATGGA6C доттттодддстстстттстттооаттстасдаотаадтатотаадсстстотгадсатттстттгоддассосттсдтс

TTC4C4GA4AAACTAAACAGAAGCATTCTCRGAAACTGC fGTTTGTGTTCCACTTCAGG4ATTAAACTTTCCT сттодсдоаасдастстадддссстсттдттстаоядтстасааатсадгатттоааааастттадаасстотгстосад

44GGAA44TCTTCAC4TAA44ACTAGAT6G4AGCATTCTCAGAAACTACTTTотодто4ттосаттсоастсдсдаАатт аддсдттсстатдаатдоаосдаоttátaддсяатстттттатяоядтстосодттааабатттагастостттаагссс тдстотдбтаааобаядтаасттсдтстаяааяссааассоадосаттсасабясадттсттаотоатяа TQcATTGAT стаасдодсстсадсаттсстттааатаасатдатттссядасясастттсtGTAGaatcYGcaастаоатдтттбааст тстстоабодтттсоттооддассааатаддсттсссабаастасясоадAGcATTGTQ4GAAAcTòñòòòñòQaòáòòò

GcATTcA4cTcAcAG4GTTGAAccTTGcTттс4тдаттс4астттс4дасдстстттттатссадтстосддстааатдт тт664сс4стттатббссттссттсоАААсааот4татсттсясАтсАAAccTAQAccQAAGcATYGTcAGAATGTTTcc

TGTGACGACTGC4TTCAACTCACAGAGATGRACAATCCTGCTGATGGAGCAGTTTTGAARCTCTCTTTCTTTQQATTCTG сдааттсататотаоассtctát64464тттсоттоадддсаабттсдтстtcacAQRAAARCYAAAcAGAAGCRttctc

4GaAAстастттатоатотттстоттссясттсддааАттоддстттсстсттодсаОаасаастгtQAAAcccTcTYtт тстаоадтстасадстааасатттабабабстттаяаасстбтоотосаддаоаадддтстtcacRTAAAAActAQATQQ адбсаттстсдсааастдстттатаятоаттбсаттсбдстсасдаяоттаадсдттсстдтдадтаоагсдоаттатаа

ACAATCTTTTTGTAGAATCTGCGATòGGAGAlòTGGACTGCTTTGAGGñCTACTGTAGTAAAQQAAAT4ACTTCATCTAA ддтссаддсасдассдттсасаGAcaattctтаатоатддттосаттоатстдacaáaаста AcattcctttAGRYGGc

GTAGTTTCCAAACACACTTTCTCT4GAATCTGCAAGTGGATATTTGàACTTCTCTQAGGATTTCQTTGGAAAC6GGATAA

ACTTCCCAG4ACTRCACGG4AGCATTGTGAG4ARCTTCTTTGYGAT6TTTGCATTCA4CTCACAGAGTTGAACCTT6CTT

TcRT4GTTc4GcTTTcaA4cAcTcTTTTYGT6GAATcTGcAAGTGGAT4тттаадссдстттотоОссттссттссдддс саат4тАтсттс4с4тсаА4сстА64с4бяябс4ттст.сА6ААтотттсстатОАсаастбГ4ттГА4стсАсдоАйота

AACAACCCTGCTG4TGGaGCaGTTTTGAaaCTTTCTTTGGATTCTGCААбТсаАТАТбТааАССТСТ6ТОААа4ТТТС6Т таааяясоатттсатсттсасасяаядястяяясдасдссаттстсяаяаастостттотодтстттстаттcсаcттса йбя4ттб4АстттсстсттаАсяаАбсябстстбА44ссстстттттсTAGA4TcTQcAAGTGGAcATTTGGAGQGcTTY

GaGGCCTGTG6TGGaAAaGGA4aaTCYтс4сЯта AAACTAGATGGAAGCATTCTCfGARACTACTTYGTGaTGAYTGCA

TTCGRCTC4CAGAGTTG4aCATTCCTRTRGATAGAGCRQGTTGTAAAC44тотттттотАаадтстссоаттааао4ттт ссдстсстттсаоссстастотяотаадасяяатаясттсдтстдядаяссдддсабдяссяттсасасасддттсттдс

TGATc4TTGGATTGAAcTAAc4GAGcTGAAcATтсстттасдтаадсадатттссддясАсастттстсса

Данная последовательность нуклеотидов относится к классу альфоидной

ДНК, т.е, обладает гомологией с d — ЗО фракцией сателлитоподобной ДНК африканской зеленой мартышки ° Последовательность содержит стоп-.кодоны во всех направлениях считывания, что прямо свидетельствует о том, что она 35 не кодирует белок.

Источником выделения маркерного фрагмента pFIS 53 служит тотальная ДНК лимфоцитов человека, очищенная методом электрофильтрации на ультра- 40 фильтрующей мембране типа ХМ-300

"Amicon". Препарат очищенной лимфоцитарной ДНК человека (полученной от индивидов мужского пола) обрабаты. вают рестриктазой Pstl до полного 45 гидролиза. Полученные рестриктные фрагменты вшивают" с помощью лигирования по "липким концам в Pstl— сайт бактериального плазмидного вектора PKNool (IZ,5 т,п.н.). Данная 50 плазмида несет ген устойчивости к тетрациклину и фрагмент ДНК фаза Nu (ген "Kill" ), обуславливающий лизис чувствительных бактериальных клеток.

Сайт Pstl PKNool располагается в ра- 55 йоне этого гена Kill, что определяет нарушение работы данного гена в результате встройки любого фрагмента

ДНК в данный сайт. Таким образом, трансформация лнг"= síîé смесью LлиаHe ризованной плазмнды и рестриктных фрагментов ДНЕ человека ) чувствительного к Мн-фагу бактернального штамма (например НБ1011 автоматически определяет селекци1с только рекомбинантных трансформантов. Наличие гена устойчивости к Тс в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки, Та— ким образом, данный вектор позволяет создать рекомбинантную клонотеку (по типу "з11ог -gUII ) прн автоматической селекции 11". среде с тетрациклином <. Тс) .

На следу1011!ем э тане Б созданнои клонотеке идентифицируют клоны обладающие гомологией с < — ДНК, Для этого рекомбинантные клоны на нитроцеллюлозных фильтрах вводят в реакLIHIG гибридиза 1ии с меченной радиоактивным фосфором (P) ДНК тотальной фрак :ии AR I — Д!1К человека, которая представлена, в основном, альфоидной ДIIК. Колонии, !!НК которых дает позитивные рефлексы на радиоавтографах в результате гибридизации, отбн-рак т и используют для определения хромосомной локалнз ацгн1 клоннроганн1.1х пих рестриктных фрагментов ДНК

)203!08 Ь человека непосредственно в цитологичсских препаратах хромосом in situ.

Для этого препараты хромосом готовят из делящихся клеток в культуре лимфоцитов челоьека по известному

5 методу, Стимулированные к делению с помощью фитогемагглютинина !. фирма Дифко", США) лимфоциты периферической крови культивируют в пенициллино вых флаконах при 37 С н среде Игла с !0 добавлением до 10% бычьей сыворотки в течение 74 ч. За час до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0„5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в !5 центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресусцендируют в гипотоническом растворе 0,07 М КС! и инкубируют )0 мин при 37 С, Фиксацию проводят метанол- 20 уксусным фиксатором (в соотношении

3.1) трижды по 20 мин, Препараты хромосом хранят при 37 С и используют в опытах не позднее 2-3-х не— дель после приготовления. 2:>

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой известным методом замещения: в 100 мкл деионизированной воды растворя,от последовательно 15 мкл де30 сятикратного буферного раствора (0 8 M трис-НС1, рН 7,4; 0,1 М МрС1 );

0,05 М дитиотреитол), 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по

0,0) ммоль каждого за исключением тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-! (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл Нтимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/ммоль,. концентрация

5 мКи/мл, )О мкл ДНК-полимеразы-1 (концентрация 2 ед/мкл) . Обт ем реакционной смеси составляет 150 мкл.

Реакцию проводят 20-40 мин при 20 С.

Средняя удельная радиоактивность ме- 45 ченых препаратов ДНК составляет около 25 х 10ь импульсов в минуту в расчете на ) мкг ДНК.

Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинант- " ной ДНК рНБ 53 с метафазными хромосомами in situ проводят па следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют в течение

30 с в 0,07 í.NaOH с последующей промывкой по !О мин B 70 и 96%-.ном этиловом спирте; прспараты радиоактивных образцов ДНК денятурируют в гибридизационной смеси, содержащей

50% формамида, 10% декстрансулъфата500 и стандартный солевой раствор (2 8БС), в течение 10 мин при 100 С; гибридизацию проводят при 37 С в течение 17-18 ч, Грепараты после проведения гибридизации промывают в двух о сменах 2 x SSC при 37 С, в двух сменах 2 x SSC при комнатной температуре, в 70 и 96%-ном этиловом спирте по

15 мин в каждой смене. После высушиванця на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней, После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты в течение 2 мин тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным ра" òâîðîì красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение !0-15 мин.

Рядиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении 1000" или )125

Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент pHS 53 локализован в прицентромерном районе

11-й пары гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером данной пары хромосом, П р и м е p !. Цельную гепаринизированную кровь от (здорового донора мужского пола) разводят О,!5 MNaC1 в объемном соотношении 1:3. Для осаждения эритроцитов разведенную кровь смешивают с 6%-ным декстрансульфатом-500 в соотношении 5:1, смесь отстаивают 30 мин при комнатной температуре; все последующие процедуры проводят при 0-4 С. Лейкоциты из надосадочной жидкости осаждают центрифугированием при 450 д в течение 20 мин и отмывают трехкратным центрифугировянием в 0,15 М ))аС1 (450 д, 10 мин).

Отмытые клетки ресуспендируют в, буфере СТМ, содержащем 0,5 М сахорозу, 50 мМ г яс HC) (pH 8,0), 5 мМ М8С1, 0,2 мМ Е1)ТА с тритоном X-100 в конечной концентрации 0,5%. Фракцию ядер отмывают трехкратным центрифугированием в том же буфере без тритона X-100 (450 g, 10 мин).."дра ресуспендируют в буфере TE .,50 мМ т ис 11C), рН 8,0; 5 мМ FDTA) из расчета:100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением саркозиля до концентрации 1%.

7 1203

Лизат инкубируют при 65 С не менее о

1 ч до полного просветления и центрифугируют 60 мин при 20000 об/мин для удаления механических примесей, Супернатант переносят в цилиндр, сни- 5 зу закрытый ультрафильтром ХМ-300 ("Amicon"), На супернатант наслаивают равный объем буфера TE + 1Z-ный саркозил. Жидкость, находящуюся в цилиндре, отделяют от анодной каме- 1О ры диализной мембраной. Нижний край цилиндра с фильтром опускают в катадную камеру;обе электродные камеры за— полняют буАером,содержащим 89 мМ

"таке НС1,89 мМ Н ВО„ и 5 мМ EDTA (рН 8,3). Электрофильтрацию раствора производят при 5 мМ/см в те гение 6-8ч. L

После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют из цилиндра, а желеобразный слой ДНК растворяют в нужном объеме

0,! ТЕ.

Для выделения препаративных количеств плазмидной ДНК культуру Е.со1, несущую плазмиду, выращивают в

100 мл среды LB (10 г/л пептана, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 r/ë

NaC1) с добавками необходимых антибиотиков (100 мкг/мл ампицилина, 20 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл хлорамфеникола) при 37 С на качалке в течение ночи. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируют в 10 мл раствора

50 мМ глюкозы, 50 мМ ТРИО -HC1 (рН 35

8,0), 50 мИ EDTA и 57 тритона Х-100, К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор лизоцима до 5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин. Затем объем пробы до- <0 водят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термастат при

65 С, ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин 45 в течение 10 мин. К супернатянту добавляют 100 мкг/мл PHK-азы A и после 2 ч инкубации при 65 С проводят фенольную, а затем хлороформную депротеинизацию, ДНК .из раствора осяж- 50 дают равным объемом изопропилаваго спирта (-18 С, 20 мин), осадок растворяют в TE. Раствор ДНК диализуют на сефадексе G-50 против 0,1 х SSC (1 х SSC 18 г/л хлористо-.î натрия 55 и 4,8 г/л цитрата натрия). Этот расо твор прогревают при 81 С в течение

10 мин и быстро охлаждают добавлением

108 8 равнога объема !М КС1+20 мМ Ханс .-НС! рН 7,1 при 0 С. Полученную смесь пропускают через колонку с нитрацеллюлозой Nitrc-Cell-S(Serva) из расчета

1 мг ДНК на 10 см объема колонки.

Фракции, сажержащие кольцевые формы плазмиднай ДР!К, объединяют, ДНК из них асажпяют равным объемом изапрапилавога спирта; осадок промывают

507 †н изапропилавым или 707-пым этилавым спиртом, высушивают пад вакуумом и растворяют в буфере ТЕ да нужной концентрации, ДНК рекомбинантных плазмид для скрининга бактериальных клонов выделяют из 5 мл ночной культуры, осаждая центрифугированием при

5000 аб/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендируют в 1 мл 25 мМ трисНС! (рН 8,0); 20 мМ ЕВТЛ, 50 мИ глюкозы и 2 мг/мл лизоцима с паследуюшей инкубацией в течение 30 мин при

0 С. К пробе добавляют ? мл раствора

0.2 н.ИяОН с 1У 8РЯ и после тщательного перемешпвания продолжают инкубацию 5 м н. К лпзяту добавляют

1,5 мл 3 М ".öe"òàòà натрия, осторожно перемешиваю-. раствор и оставляют ня чяс при 0 C. .Образующийся осадок удаляют центрифугираванием (12000 об/мт ",, 20 мпн), нуклеиновые кислоты из супернатянта осаждают о

2,5 абъемямп этилового спирта (-18 С.

30 мин), C!ñeягок растворяют в мл

50», тр;!а -НС1 (рП 8,0) + 0,1 N ацетатя натрия H переасаждают зтянолом. Процедуру переасаждения повторяют дважды, конечный осадок после высушивания растворяют в 100 мкл ТЕ.

Эпдонук.:еязвую обработку ДНК человека и бяктсрияльпых плазмид проводят в буфере 1ЕВ, содержащем 10 мМ

1-Рце -HC1 (рП 7,- i), 10 мМ >igClg, 10 мМ NaC1 и и, 1 дитиатреитала (DTT).

Полный эндонуклеязный гидролиз ДНК достигают при относительной концентрации рестриктаз 5-8 ед/мкг ДНК после проведения реакции в течение

2 ч при 37 С, Реакцию останавливают прогреванием пробы при 70 С в течение 10 мин либо добавлением 1/4 абъе мя смеси О,!7-ного раствора БР8, 25i-íîão раствора сахаразы, 5 мМ ацетат натрия и 0,05г-ного раствора

1 брамфеналавага синего.

Для получения генамнай кланатеки

ДНК человека в качестве вектора используют бяктерияльную плазмиду

1203!

pKNool, несущую ген устойчивости к тетрациклину, и последовательность фага II> обуславливающую признак убийства", в которой расположен уникальный сайт для рестриктазы Pstl, Данное сочетание позволяет проводить одноэтапный отбор рекомбинантных клонов при клонировании фрагмента ДНК человека в Pst!-сайте пйазмиды.

Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды

LB инокулируют 1 мл свежей ночной культуры Е.coli НВ101 и выращивают на качалке при 37 С до мутности

Agg0 =0,4-0,5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10-15 мин, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин на холоде, Осадок промывают равным объемом охлажденного до

0 С раствора 100 мМ СаС1, клетки осаждают и ресуспендируют 12 мл

100 мМ CaC!q . Клеточную суспензию выдерживают на холоду 20-30 мин, ) 4 центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл О,! М СаС1 с 15%-ным глицерином. После инкубации полученной суспензии при 0 С по крайней мере в течение 30 мин культура готова к трансформации, Культуру хранят в малых порциях при -80 С, при этом компетентность сохраняется по крайней мере в течение 4-5 месяцев.

К 200 мкл компетентной культуры б бактерий при О С добавляют 0,1—

0,2 мкг лигированной ДНК и инкубируют при этой температуре в течение

45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (42 С) на 60-90 с и 40 снова помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон LB и подращивают ее на качалке 2-3 ч при 37 С. Трансформанты высевают на плотную среду с

l,5% агара (по 0,1 мл культуры на чашку Петри)и добавками необходимых антибиотиков, обуславливающих селекцию трансформированных клонов.

30 мкл раствора, содержащего О,! gIE

0,2 мкг плазмидной ДНК или 0,! мкг препаративно выделенного из геля фрагмента и 1 мкл ДНК-азы-1 в 0,015М

ЛаС1, 5 мМ СаС1 и 5 мМ МяС1, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, ДНК-азу-1 инактивируют при о

70 С, 10 мин., после чего к раствору добавляют буферный раствор 0,4 М

08 l0

ТРис --HC! (рН 7,4), 50 мМ 1!еС1т, 25 мМ ВТТ (до 1/5 конечного объем по 1 н молю каждого из не меченых предшественников ДНК, 20-40 мкКи од37 ного из 0(— Р-дезоксинуклеозидтрифосфатов с удельной активностью 110 ТВ (ммоль (3000 Ки/ммоль) (Amersham) и

1 ед. II!1 K- полимеразы-1 . Объем реакционной смеси„ как правило, составляет

100 мкл, реакцио ведут в течение часа гри 37 С. Радиоактивность кислотонерастворимой фракции ДНК измеряют на счетчике L К8 !215 по специальной программе, Средняя удельная активность меченых препаратов составляет

2-5 х 10 имп/мин/мкг ДНК, Я

Для идентификации вставок ДНК -еловека в составе гибридных клонов бактериальные колонии, предвар1-.""=-льEIo тестированные по фенотипу KaK рекомбинантные, репликой наносят на нитроцеллюлозные фильтры (пп11 роге, 1IA4P), находящиеся непосредственно на поверхнссти твердой питательной среды в чашках Петри, и выра !ивают их в течение суток при 37 С, Вь.рос— шие колонии вмссте с фильтром переносят на поверхност> раст ога 0,5 М

1!а011 и оставляю-. IIa 5-10 ми:;:, Подсушив фи;и тр с нижней стороны "Iëbòðoвальной бумагой, его дважды по !Омин обрабатывают раствогом :; т1!1с -IIÑI (рН, 7,5),, а затем .,5 И 11аС! с 1 М

ГР1!с I!C l (pI" 7, 5), Вы(уш нный на воз- духе фильтр помешают в раствор

2 х SSC с протеиназой К в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в нем

30 мин при 37 С. Далее подсушеннь и

Ф фильтр промыва от в 0,3 М NaC1,, а затем сушат под вакуумом при 80 С !»

Перед гибридизацией фильтр вымачивают при 68 С в растворе 2 х SSC

0,5,, SDS, 0,1% фикол-400 и 0,1% поливинилпирролидон-350 в.течение 6090 мин, Вслед за этим фильтр насухо промакивают фил:ьтровальной бумагой и помещают в 4-5 мл гибридизационной смеси,, ".îäåðæàùåé 6 x SSC, 0,1% SDS

l0% декстрансульфата-500, 50 мкг/мл поли (A) и денатурированную пробу

32 э

1 -меченой ДНК с суммарной активностью.1-5 х 10 имп/мин. Гибридизацию проводят при 68 С в течение 1824 с. Фильтры промывают в нескольких сменах раствора 0,5 х БЯС с 0,5% SDS

oà при 68 С в течение нескольких часов, Отмытые фильтры окончательно высушиI?0:3108 1? вают и помещают н кассету с рентгеновской пленкой Р)1-1. Через 2-24 ч экспозиции проявляют радиоавтографически и по наличию положительных сигналов (участков почернения округлой формы) идентифицируют гибридные клоны.

Описанным способом ставят опыт на трех фильтрах-репликах с клонотекой

Pst) фрагментов ДНК человека. При 10 этом в качестве зонда для гибридизации с колониями на фильтрах берется проба альфоидной ДНК человека, выделенной препаративно из агарозного геля после электрофоретического раз- )5 деления гидролизата геномной ДНК человека эндонуклеазой EcoR) и идентификации полосы AR) (340 н.п,). В указанный образец ДНК вводится изотопная метка описанным методом замещения. После гибридизации на колониях положительный сигнал обнаруживается особенно четко на двух колониях, одна из которых получила название pHS 53

Ь соответственно ее порядковому номеру в исходной клонотеке, Препараты хромосом готовят в культуре лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитогемаглютинина (фирма "Дифко", США) в пенициллиновых флаконах при

37 С в среде Игла с добавлением до

)0 бычьей сыворотки в течение 74 ч.

За час до конца культивирования вводят колхицин в концентрации

0 5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение

5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе

0,07 M КСI и инкубируют в течение

10 мин при 37 С. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:)) трижды по 20 мин. Прео параты хромосом хранят при 37 С и используют в опытах не позднее 23-х недель после приготовления, Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах п situ метят.изотопной меткой методом замещения: в 100 мкл 50 деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М т) ис-НСI, рН 7,4; 0,1 M MgC1 z, 0,05 М дитио.треитол, 5 мкл нерадиоактивных дез- 55 оксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси ),по 0,1 мМ каждого за исключением тимидинтрифосфата), 5 мкл Д!!Š†а-) (концентрация

1 ;кг/мл), !О мкл Н-тимидинтрифос3 дата (удельная активность !

14 Ки/ммоль, концентрация 5 мКн/мл), 10 мкл ДНК вЂ” полимеразы ) (концентра— цйя 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл ° Реакцию ведут в течение 20-40 мин при 20 С.

Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25 х 10 импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.

Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК pHS 53 с метафазными хромосомами in situ проводят с предварительной денатурацией в течение 30 с в 0,07 н ИаОН с последующей промывкой по 10 мин в 70 и 96 -ном этиловом спирте. Препараты редиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50 формамида, )O декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 х SSC), в течение 10 мин при

100 С. Гибридизацию проводят при о

37 С в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2 х SSC при 37 С, в двух сменах 2 х SSC при комнатной температуре, в 70 и 96 .-ном этиловом спирте по 15 мин в каждой смене.

После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа И и экспонируют в темноте до 10 дней.

После проявления стандартных амидоловым проявителем в течение 2 мин препараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают З .-ным раствором красителя Романовского-Гимза в

0,02 M фосфатном буфере (pH 6,8) в течение )0-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении 1000 или

))25

Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент рН8 53 локализуется только в прицентромерном районе 11-пары гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером даннои пары хромосом, Пример 2. Особенно важным является применение предлагаемого молекулярного маркера для распознавания 11-й хромосомы в тех случаях, когда эта хромосом» (один из ся непосредственно под микроскопом.

Пример 3, Важной иллюстрацией практического применения молекулярного маркера р1)Б 53 для 11-й хромосомы является опыт по идентификации присутствия этой хромосомы в

40 клеточном ядре непосредственно по картине интерфазных (неделящихся) ядер. Как известно, хромосомы чело- 45 века анализируются только в метафазе митоза после специальных обработок,, облегчающих подсчет и анализ морфо-логии хромосом, Исключением является половая.Х-хромосома, наличие ко- . 0 торой в норме у женщин можно установить по наличию в интерфазном ядре компактного тельца полового хроматина, образованного одной из двух

Х-хромосом в женском наборе, Однако с помощью молекулярного маркера

pHS 53, специфически маркиру щего только ll-e хромосому человека, на)3 гомологов данной пары) затронута це рестройкой, т.е. имеет потерю какого-либо участка или, напротив, добавку хромосомного материала, что будет сказываться на размере 1)-й хромосомы и ее форме, Все процедуры по выделению образца ДНК рН$ 53 и его обработки с иэотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in sitL1> а так-)0 же все процедуры по приготовлению препаратов метафазнь.х хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1, Отличие состоит только в том, что в примере I используются препараты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 2 используются препараты хромосомного набора женщины, являющейся носителем сбалансированной транслокации (переноса), терминальной трети короткого плеча ll-й хромосомы на конец длинного плеча

8-й хромосомы, В результате такой транслокации короткое плечо Il-й хромосомы значительно укорочено и при обычном визуальном осмотре метафазной пластинки с данной перестройкой под микроскопом диагностика указанного

30 арушения требует высокого уровня, итогенетического анализа. Однако с помощью молекулярного маркера рН$ 53 для ll-й хромосомы гомологичный партнер с укороченным коротким плечом в этой паре легко распознает-

) ОЯ ) (> ли-.ие этой хромосомы в клеточном ядре можно уcтанавпивать без приготовления препаратов метафазных хромосом, а только по анализу изображений интерфазных ядер, Это обусловлено тем, что образец ДНК рНБ 53 гибридизируется с ДНК припентромерного района 1)-й хромосомы и в том случае, когда эта хромосома находится в расплетенном состоянии на стадии интерфазы. Б этом случае в каждом интерфазном ядре можно видеть (после гибридиэацш. и приготовления радиоавтографов) два практически одинаковых по размеру скопления зерен серебра (сигналов изотопной метки), если гомологичные партнеры 11-й пары расположены в неделящемся ядре на достаточном расстоянии, или одно крупное скопление зерен метки, если оба партнера расположены поблизости.

Все процедуры по выделению образца ПНК pHS 53 и его обработки с изотопной меткой для гибридиза сии на интерфазных ялрах„ а также все процедуры по приготовлению препаратов клеток из культуры лимфоцитов периферической крови повторяются аналогично таким же процедурам, описаíнь|м в примерах 1 и 2. В каждом интерфаэном ядре обнаруживаются два крупных скопления гранул метки, соответствующих двум гомологичным хромосомам )1-й пары. В разных ядрах расстояния меж ду этими скоплениями различны. Таким обра30M, появляется реальная воэможность впервые непосредственно в интерфазных ядрах анализировать располо— жение гомологичных партнеров конкретной пары хромосом в клетках человека, что представляет большой научный интерес с точки зрения функциональной организации наследственных структур человека, Таким образом, клонированная последовательность ДНК рНЯ 53 иэ генома человека является эффективным инструментом для распознавания 11 é xpo»oñомы человека как в стандартных препаратах нормальных хромосомных наборов или в случаях с перестройками 1)-й хромосомы, так и в препаратах интерфазных ядер. Укаэанные воз— можности расширяют область применения хромосомного анализа в практикемедико-генетического консультирования,включая пренатальную диагностику случаев с перестройками 11-й хромосомы человека. Возможно эффек16

1203108

Составитель В ° Голимбет

Техред А.Бойко Корректор. А Тяско

Редактор Н,Егорова

Заказ 8387/31

Тираж 524 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4

l5 тинное применение предлагаемого способа в анализе гибридных клеточных линий (человек-грызун), широко используемых для цитогенетического картирования нормальных и мутантных генов человека.