Способ определения кислой фосфотазы из печени животных

 

Изобретение относится к биохимии и касается исследований в энзимологии. Целью изобретения является повышение чувствительности и точности способа. Готовят гомогенат из печени животных и вьщеляют из гомогената обогащенную фракцию лизосом, которую используют в качестве источника фермента. Фермент инкубируют с забуференным р-глицерофосфатом натрия. Инкубацию проб прекращают добавлением НСЮ . В супернатанте определяют . Р . Проба содержит аскорбиновую кислоту и молибдат аммония в соотношении 2:1-12:1. Величину оптической плотности измеряют при 820 нм на спектрофотометре. Удельную активность кислой фосфатазы выражают количеством нанокаталов, отнесенным к 1 кг белка. 3 табл. (Л с tN3 CD 4

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU „„129477) А1 (я) 4 С 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н AВтО) Скому са тельСтвм

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3898994/28-13 (22) 21.05.85 (46) 07.03.87. Бюл. Ф 9 (71) Университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы (72) С.П. Сяткин и В.А. Фролов (53) 577.15.08 (088.8) (56) Лизосомы. Методические исследования. /Под. ред. Д. Динчов, — М.:

Мир, 1980, с. 124-125. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к биохимии и касается исследований в энзимологии. Целью изобретения является повышение чувствительности и точности способа. Готовят гомогенат из печени животных и выделяют из гомогената обогащенную фракцию лизосом, которую используют в качестве источника фермента. Фермент инкубируют с забуференным Р-глицерофосфатом натрия.

Инкубацию проб прекращают добавлением НС10 . В супернатанте определяют, P, . Проба содержит аскорбиновую кислоту и молибдат аммония в соотношении 2: 1-12: 1. Величину оптической плотности измеряют при 820 нм на спектрофотометре. Удельную активность кислой фосфаъазы выражают количеством нанокаталов, отнесенным к 1 кг белка. 3 табл.

1 t 2947

Изобретение относится к биохимии и касается исследований в энэимологии.

Целью изобретения является повышение чувствительности и точностй способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Ферментный препарат (0,1-7,2 мг белка) инкубируют в присутствии суб страта (27,7-24,4 мкмоль на 1,71,5 мл конечного объема) в О, 1 М ацетатном буфере рН 5, приготовленном на 0,7 М растворе сахарозы.Инкубацию проб при 37 С прекращают через 30 мин добавлением 0,5 мл 0,2 М .HC10 . В 0,9 мл супернатанта, полученного при центрифугировании проб при 5000 об/мин, определяют P, .

Пробы содержат 100 мг аскорбиновой кислоты и 25 мг молибдата аммония 4Н О, приготовленного на 1 и. серной кислоте, на 3 мл конечного объема. Инкубирование при 45 С заканчивают через 20 мин, охлаждают и измеряют величину оптической плотности пробы против контроля на реактивы и растворители при 820 нм на спектрофотометре. Абсолютное количество фосфата в пробе определяют по калибровочному графику и считают его эквивалентным количеству гидролизованного субстрата. 3а единицу ферментативной активности принимают 1 катал.удельную активность кислой фосфатаэы вы- 35 ражают количеством нанокаталов, отнесенным к 1 кг белка. Белок определяют методом ЛоуриПример. В работе используют интактных самцов кроликов породы Шин- 40 шилла массой 2,5-3,5 кг. Печень берут у наркотизированных гексеналом животных., перфузируют на льду ледяным физраствором, промокают бумажными фильтрами, тщательно очищают от соедини- 45 тельной ткани и взвешивают. Гомогенат готовят из расчета 1:9 (вес ткани на объем среды для гомогенизирования).

Гомогенизацию проводят в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Зльвейема с 50 тефлоновым пестиком (зазор 0,21 мм) в течение 30 с при 1200 об/мин. В качестве источника фермента используют обогащенную фракцию лизосом, полученную дифференциальным центрифуги- 55 рованием с использованием градиента сахарозы. Осадок ресуспендируют в среде для гомогенизирования и, до71 2 бавляя в среду для инкубации тритон

$-100 до конечной концентрации О 10,2, определяют общую активность фермента. Доступную форму активного этого фермента определяют аналогичным образам,: но беэ добавления в среду инкубации детергента. В суперна анте этой фракции измеряют величину активности свободной (неседементнруемой) формы этой гидролазы. Доля активности свободной формы фермента относительно общей, вшраженная в процентах, была мерой (показателем) целостности лизосомных мембран (ПЦЛМ), а разница между доступной и свободной формами энзима, выраженная аналогичным образом, служит показателем степени их проницаемости — лабилизацин (ПЛЛМ).

Активность кислой фосфотаэы (КФ

3.1.3.2) определяют по приросту в пробе Р; при инкубации О, 1-0, 2 мг белка с Р -глицерофосфатом натрия (27,7 и 24,4 мкмоль на конечный объем в

1,7 мл для общей и 1,5 мл для доступной и свободной форм активности фермента) в 0,1 М ацетатном буфере рН 5, приготовленном на 0,7 М растворе сахарозы. Инкубацию проб при 37 С пре1кращают через 30 мин добавлением

0,5 мл 0,2 М НС10 . Контрольная проба содержит те же компоненты, кроме ферментного препарата, который добавляют сразу после хлорной кислоты.

В 0,9 мл супернатанта, полученного при центрифугировании проб при

500 об/мин, определяют Р..

Проба содержит 100 мг аскорбиновой кислоты н 25 молибдэта аммония х «4Н О приготовленного на 1М серной кислоте, на 3 мл конечного объема. б

Инкубирование проводят при 45 С н заканчивают через 20 мин, охлаждая пробы и измеряя величину ее оптической плотности против холостой пробы. Абсолютное содержание Р в пробе находят по калибровочному графику и считают его эквивалентным количеству гидролиэованного субстрата. Величину оптической плотности окрашенных растворов измеряют на спектрофотометре.

За единицу активности фермента принимают 1 катал„ Удельную активность кислой фосфатазы выражают количеством нанокаталов, отнесенным к 1 мг белка. Все препаратнвные процедуры с б тканью печени осуществляют при 0-4 С на холоде. Белок определяют методом

Оценка достоверности результатов

40 определения активности кислой фосфатазы из печени кролика дана в табл.2.

3 1294

Лури. Все численные результаты опытов подвергают статистической обработке.

Зависимость величины оптической плотности (A „. стандартного (1О мк М) раствора неорганического фосфата от 5 соотношения концентраций аскорбиновой кислоты (С,) и молибдата аммония (C,) в аналитическом реагенте представлена в табл.1.

l 1О

Из табл. 1 видно, что максимальная величина оптической плотности стандартного раствора фосфата становится при соотношении концентраций растворов аскорбиновой кислоты и молибдата аммония 2. Дальнейшее увеличение этого соотношения не влияет на величину экстинции исследуемого раствора ввиду ограниченного растворения аскорбинбвой кислоты в воде (33 г на

100 мл), максимальная величина этого коэффициента может быть 12. Этими значениями определяется эффективный диапазон концентраций аскорбиновой кислоты в аналитическом реагенте.

Сравнивают калибровочные зависимости для предлагаемого метода и известного тангенсы угла наклона равны 0,029 и 0,019 для указанных способов соответственно. Поскольку это соответствует коэффициентам инструментальной чувствительности (Б qi ),, то относительная чувствительность фотометрической реакции предлагаемого ,метода в 1,5 раза выше известного.

Величина кажущегося десятичного.молярного коэффициента экстинции данной фотометрической реакции (Я

= 30 500) также в 1,5 раза выше чем в известном способе (Е = 19 000).

Калибровочные зависимости в выбранных диапазонах концентраций косят линейный характер, что позволяет использовать основной закон светопог-.

: 45 лощения для вычисления величины- относительной чувствительности определения. Предлагаемый способ (Смин =

= 0 18 мкМ) в 1,5 раза чувствительнее известного (Смин = 0,26 мкМ).

Поскольку при большем значении коэф50 фициента инструментальной чувствительности и кажущегося десятичного молярного коэффициента экстинкции погрешность определения меньше точность определения активности кислой фосфатазы предлагаемым методом выше, чем в известном способе.

771 4

Способ опробируют, определяя активность различных форм фермента из печени интактных животных.

Значение случайных погрешностей данного метода оценивают, рассчитывая основные метрологические характеристики d,w,S,Å,n,S, являющиеся мерой воспроизводимости, из результатов десяти параллельных определений. Значения удельной активности всех форм фермента близкие к приводимым в,литературе. Стандартное отклонение среднего результата не превышает 1Х, степень рассеивания отдельных измерений около средней низкая (менее 5X), выборка однородна.

Проводят измерение активности кислой фосфатазы в течение шестичасового периода ночного времени суток, с 0 ч. В течение выбранного периода времени активность исследованной гидролазы претерпевает существенные изменения. К 3 ч ночи она несколько возрастает, а к 6 ч утра значительно снижается, общая и доступная формы— в 2 раза, свободная - 1,5 раза.Аналогичным образом изменяется показатель целостности лизосомальных мембран. В изменении активности этих двух форм фермента наблюдается наибольшая синхронность. Противоположный характер носит динамика показателя лабиализации лизосомных мембран.

Наименьшее значение показателя лабиализации лизосомных мембран приходит(ся на 3 ч ночи.

Уровень активности различных форм кислой фосфатазы и показатели структурно-функционального состояния лизосом з печени кроликов даны в табл.2.

Формула изобретения

Способ определения кислой фосфатазы из печени животных, включающий смешивание ферментного препарата печени с субстратом, инкубацию смеси, остановку ферментативной реакции кислотой,добавление аналитического реагента с последующим спектрофотометрированием, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и точности способа, в ка1294771

Продолжение табл.1

Таблица

0,75

0,5

0,14

0,25

0,1

Таблица 2

Активность, вкатал/кг белка

Основные метрологические характеристики

I I

Общая Доступная Свободная

Выборочное среднее, х 10

137

Стандартное отклонение среднего результата, + S ° 10

0,4

0,9

0,64

2„8

0,9 относительное среднее отклонение, Е„

1,6

1,5 относительное стандартное отклонение, S„

2,7

2,1

2,0

H p и м е ч а н и е. Расчеты статистических показателей проводят на основании результатов десяти параллельных определений фермента из печени животного, взятой в 0 ч. честве аналитического реагента используют смесь молибдата аммония с аскорбиновой кислотой нри их соотношении 1 2 — 1: 12.

0,285

О, 284 15

Абсолютная воспроизводимость: среднее отклонение от среднего, 1 10- вариабильность, w ° 10 стандартное отклонение, S 10-

Относительная воспроизводимость:

0,280

0,252

О, 185

0,032

0,013

12947»

Таблица 3

Характеристики

Активность, (нкатал/мг) 10 общая доступная свободная

65 + 9 23 1,6

26+ 2,9

59 ++6, 8 34 + 4, 2

0,18+ 0,03 0,08 0,02 0,23 «+0,03

П р и м е ч а н и е. Результаты на материале от пяти животных, взятом в течение 1 сут в указанные часы.

Составитель И. Тареева

Редактор Н. Гунько ТехредЛ.Олейник Корректор М. Пожо

Тираж 777 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 552/24

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная,4

137 +18

61+8

34+3

Время суток, ч (Э (6

144 + 30 67 «+ 9

72 +10 . 32 «+ 3