Способ определения активности l-лизин- @ -оксидазы

 

Использование: микробиология, фармацевтическая промышленность, медицина . Сущность изобретения: готовят реакционную смесь, содержащую, об:%: фосфатный буфер 0.7-0,8; водный раствор L-лизина с концентрацией 1,46 мг/мл 0,1; водный экстракт культуры гриба рода Trichoderma 0,1-0,2. После инкубирования смеси дополнительно вводят в нее 0,1- 0,8%-ный раствор люминола с рН 10,0-13,8, в 1 л которого растворено 0,04-10,00 мг гемина. Соотношение реакционной смеси и люминолгеминового состава устанавливают равным 1:10. Результат оценивают люминометрическим методом. 5 ил., 1 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИ IECKMX

РЕСПУБЛИК (sI)s С 12 0 1/32

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4849029/13 (22) 17.04.90 (46) 30.06.92, Бюл. М 24 (72) B,А.Ишутин (53) 577.15.08 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССРhh 1163268, кл. С 21 Q 1/00. 1983. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ L-ЛИЗИН- а-ОКСИДАЗЫ (57) Использование: микробиология, фар. мацевтическая. промышленность, медицина, Сущность изобретения: готовят

Изобретение относится к энзимологии и может быть использовано при определении активности . ферментов, катализирующих в субстратах образование перекиси водорода в микробиологической промышленности, медицине. фармакологии и,других отраслях науки и техники.

Активность ферментов определяют по количеству расщепленного субстрата или образованию определенного количества продукта эа единицу времени 1 мг фермента; по числу микролитров субстрата,.потребляемого (в стандартных условиях) в течение

1 ч на 1 мг фермента; числом микромолей или молекул субстрата, прореагировавшего за 1 мин íà 1 мг фермента.

Эти способы многостадийны и продолжительны по времени. Для их исполнения необходимы редкие- и дорогие реактивы, специалисты, приборы и оборудование.

Известен способ определения активности L-лизин-а -оксидаэы в культуре гриба рода Trfchoderma sp. по 0.04%-ной перекиси водорода, Способ заключается в том. что фермент .

L-лизин-а-оксидазу получают путем культи. Ж, 17441 14 А1 реакционную смесь, содержащую, об: ; фосфатный буфер 0,7-0,8; водный раствор

L-лизина с концентрацией 1,46 мг/мл 0,1; водный экстракт культуры гриба рода

Trichoderma 0.1-0.2. После инкубирования смеси дополнительно вводят в нее 0,10,8%-ный раствор люминола с рН 10,0-13,8. в 1 л которого растворено.0,04 — 10,00 мг гемина. Соотношение реакционной смеси и люминолгеминового состава устанавливают равным 1:10. Результат оценивают люминометрическим методом; 5 ил., 1 табл. вирования штамма Trichoderma harzianum

Rifai F — 180 в 250 мл колбе с 10 г пшеничных отрубей, 7 мл 11,4%-ного йайОЗ, 10 мл HzO (/) при 28 С в течение 14 дн. Затем в колбу добавляют 10 мл Н20, в течение 2 ч культуру встряхивают на Schutelaparat-327. ("PrerId"

ПН Р) и отжимают через хлопчатобумажную ткань, а водный экстракт центрифугируют от

° авеЬ спор и мицелия и определяют активность

L-лизин- а -оксидазы. Реакционная смесь содержит, об. на 1 мл: 0,5 М трис — НС1

15-30, 5 мкМ 1=лизин 50-55, 0,04%-ная пе- . 4hi роксидаза 4 — 5, 0;5%-ный 0-дианиэидингид- в рохлорид 4 — 5, водный экстракт культуры а

12-20, - фь, Смесь инкубируют аэробно при 37 С

20 мин и охлаждают. Реакцию заканчивают добавлением 1 мл 0,8 н.НС! и последующим охлаждением пробы до комнатной температуры. Оптическую плотность окрашенных растворов замеряют на спектрофотометре при 540 нм, Нижняя граница чувствительности 0,1 нмоль, воспроизводимость «+0,1 нмоль. 3а единицу активности фермента принято количество фермента, ка1744114 талиэирующего образование 1нмоль перекиси водорода за 1 мин в стандартных условиях.

Однакоэтотспособтакжесложен и продолжителен по исполнению. Используемый в реакции реактив 0-дианизидингидрохлорид является высокотоксичным веществом.

Он, как и пероксидаэа, является дорогостоящим и редким веществом. Точность способа невелика, поскольку нельзя утверждать, что за время инкубирования реакция завершилась полностью.

Цель изобретения — удешевление, упрощение, ускорение способа определения активности фермента, повышение его точности и безопасности для человека.

Поставленная цель достигается использованием нового состава реакционной смеси, содержащей, об.% на 1 мл, фосфатный буфер 0,7 — 0,8, водный раствор L-лизина концентрацией 1,46 мг/мл 0,1, водный экс,тракт культуры 0,1 — 0,2.

Смесь инкубируют азробно при 37 С 20 мин и в нее дополнительно вводят 0,1 — 0,8%ный раствор люминала с рН 10,0 — 13,8, содержащий гемин из расчета 0,04 — 10 мг/л раствора люминола при соотношении реакционной смеси и люминолгеминового состава 1:10, Результат оценивают люминометрическим методом.

Исключение из реакционной смеси

HCI, О-дианизидингидрохлорида, пероксидазы повышает безопасность способа для человека и удешевляет его. А использование люминолгеминового состава в смеси повышает чувствительность способа, так как люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) в щелочной среде в присутствии таких катализаторов, как медь, кобальт и наличие в ней перекиси водорода дает яркое свечение. Особенно резко оно усиливается в присутствии гемина, который является для перекиси водорода одним из самых сильных из всех известных в природе катализаторов, При введении в реакционную смесь люминолгеминового состава при наличии в ней перекиси водорода возникает перенос электрона (гомолиз)

Fe ++ H0z Ее + Н20

Fe + HzOz e + НО + HO и последующие реакции

H0+ HzQz HzO+ H0z

НОр+ HOz zO+ 02 °

В процессе последних реакций комбинации свободных радикалов образуются короткоживущие соединения типа ассоциированного и неассоциированного Ван-дер5 Ваальсовского комплексов кислорода, обладающие избыточной энергией, которая трансформируется люминолом в световую по реакции

ОН

C=N

t +0 =N

ОН

ОН

E мн ОК

20 С00

-+ 2+ Ь, СОО!

0Н

25 Для регистрации квантов света используют анализатор, чем повышается точность определений.

Диапазон эффективных концентраций люминала в щелочи и гемина в растворе

30 люминола определяли следующим образом.

Готовили раствор люминола в щелочи (КОН) концентрацией 0,276 мг/л и на его основе готовили люминолгеминовый состав с концентрацией гемина от 0,01 до 12 мг/л

35 в растворе люминола. Готовили растворы люминола в щелочи концентрацией 0,05—

1,0% и в каждом из них растворяли навески гемина из расчета его концентрации в растворе люминола 0,1 мг/л. Готовили разведе40 ния перекиси водорода концентрацией

1-10 нмоль и с помощью анализатора проводили их аналиЗ, используя приготовленные люминолгеминовые составы. По результатам анализа строили графики в ко45 ординатах: величина измеряемого сигнала ф A) — концентрация перекиси водорода (нмоль).

Графики приведены на фиг. l и 2.

Из фиг. 1 и 2 видно, что эффективными

50 концентрациями люминола в щелочи являются концентрации 0,1-0,8%, а для гемина в растворе люминала они лежат в пределах от 0,04 до 10 мг/л.

Поскольку шкала анализатора не отгра55 дуирована в единицах концентрации перекиси водорода, то ее определяли по калибровочному графику (см.фиг.3), полученному по результатам анализа разведений перекиси водорода с помощью люминолгеминового состава, в котором кон1744114 центрация люминола в щелочи составляет

0,276 мг/л, а навеска гемина растворена из расчета его концентрации в растворе люминола,равной 0,1 мг/л.

Пример. Определяли активность L-лизин-а-оксидазы в водном растворе культуры..

Брали емкость из стекла с притертой пробкой объемом 150 мл, наливали в нее 0,15;4-ный щелочной (рН 12,8) раствор люминола и растворяли в нем навеску гемина массой 0,04 мг 10 в течение 3 мин при.комнатной температуре.

В двух чистых колбах с притертыми пробками параллельно готовили .реакционные смеси, содержащие, об, ф на 1 мл: фосфатный буфер (pH=5,7-5,9) 0,7 — 0,.8, водный раствор 1=лизи- 15 на концентрацией 1,46 мг/л 0,1, водный экстракт культуры 0,2 — 0,1.

Колбы закрывали пробками и инкубировали аэробно при 37 С 20 мин, после чего в . смесях колб без охлаждения и остановки 20 реакции HCl определяли перекись водорода с помощью люминолгеминового состава нв анализаторе. Для этого прибор подключали к источнику питания и оно подавалось. на блок 1 питания (см.фиг.4). Далее с блока .25

1 питания напряжение подавалось на блок .

2 преобразования напряжения, откуда низковольтное напряжение подается на блок 8 регистрации времени измерения и блок 7 управления. Высоковольтное напряжение.30 подается на блок 3 отключения напряжения, блок 4 преобразования светового сигнала в электрический.

Ь

С подвижного стакана 19 (см.фиг.5) блока 4 преобразования светового сигнала в 35 электрический снимают крышку 11, дозатор

14 и из него извлекают пробирку 17. В пробирку помещают 0,1 мл анализируемой ре- . акционной смеси, устанавливают ее снова в подвижный стакан 19 и на него устанавли- 40 вают дозатор 14. В полость 13 дозатора 14 наливают 1 мл люминолгеминового реакти-. . ва, закрывают ее крышкой 11 и нажимают на нее рукой. Под действием нажатия стакан 19 перемещается до упора вниз, где он 45 фиксируется рычагом 23. При этом отверстие 16 в стакане 19 совмещается с чувствительным элементом 18 ФЭУ. При достижении стаканом 19 упора от нажатия руки деформируется резиновая прокладка 50

12 в крышке 11 и через отверстие 15 в дозаторе 14 люминолгеминовая смесь вводится в пробирку 17. При взаимодействии люминолгеминовой смеси с перекисью водорода, образовавшейся в реакционной смеси, в 55 пробирке 17,выделяются кванты света, ко,торые ФЗУ преобразуются в электрический сигнал, Он поступает на аналого-цифровой преобразователь 5 (см.фиг,4), откуда поступает нв блок 6 индикации и блок 9 регистрации его внешними регистрирующими уст ройствами. Положительный эффект способа оценивали по результатам анализа перекиси водорода Концентрацией 0,01 нмоль с помощью люминолгеминовой смеси на анализаторе, По результатам анализа определяли среднеквадратическую ошибку и оценивали меру точности.

Результаты анализа приведены в таблице.

Истинное значение измеряемой величины сигнала лежит в интервале 0,1918—

0,788 с надежностью 0,99. За единицу активности фермента принято количество фермента,катализирующего образование 1 нмоль перекиси водорода-за 1 мин в стандартных условиях, Активность фермента в первой колбе составила 1,43 ед. (14,7 ед/мл экстракта), а во второй 2,74 ед, (13,7 ед/мл экстракта). Нижняя граница чувствительности 0,01 нмоль. воспроизводимость

0. 01 н мол ь.

Использование предлагаемого способа обеспечивает следующме преимущества: исключается использование редких, дорогих и ядовитых реактивов, что делает процесс определения активности фермента безопасным для человека и дешевым по стоимости; повышена чувствительность способа в 10 раз; обеспечивается возможность контроля кинетики накопления перекиси водорода в реакционной смеси при ее инкубировании, что позволяет оценивать качество фермента; реактивы и прибор отечественного производства и внедрить предлагаемый способ в практику не составляет труда.

Формула изобретения

Способ on ределения активности L-лизина-оксидазы в водном экстракте культуры гриба рода Trichoderma, лредусматриваю- щий приготовление реакционной смеси, состоящей из фосфатного буфера, водного раствора L-лизина и водного экстракта культуры, инкубирование ее в термостате с последующей оценкой результатов, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, его упрощения, ускорения и безопасности, компоненты реакционной смеси берут в следующем количественном соотношении, o0. :

Фосфатный буфер 0,7-0,8

Водный раствор L-лизина с концентрацией 1,46 мг/мл 0,1

Водный экстракт культуры 0,1-0,2 после инкубирования в реакционную смесь дополнительно вводят 0,1-0.8ф-ный раствор люминола с рН 10.0-13,8. содержащий гемин из расчета 0,04-.10,0 мг/л раствора

1744114 люминола, при соотношении реакционной смеси и лвминолгеминового состава 1:10, а

8 У ro

3 4 5 6 1 о

Концентрация перекиси водорода, аюоюь о у с

Ф и

Ж

2а результат оценивает люминометрическим методом.

1744114 з

2о

Фиг,Я е

К

Р.

X а

° 4!

X к

Cl трация перекиси водорода, пмоль онцен

Фи8. Л

О Ц 02 0,5 .04 O,Ф . С6 О,4 08

Концентрация перекиси водорода, моль

1744114

М

1$ 16 18

f7

l9

Составитель Е.Полезаев

Редактор М.Недолуженко Техред М.Моргентал Корректор М.Пожо

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2169 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5