Способ трансдукции хромосомных маркеров и плазмид у yersinia реsтis

 

Изобретение относится к бактериальной генетике, именно к спосоИзобретение относится к области бактериальной генетики, а именно к области переноса генов микроорганизмов с помощью трансдукции. Цель изобретения - повьппенйе частоты трансдукции и упрощение способа . Это достигается путем использования фага Р1 cml clr 100 ts pi, который является производным фага Р1 cml clr 100 ts, способного размножаться на культуре чумного микроба в слое мягкого агара с образованием негативных колоний, что обеспечивает возможность: получать без дополнительного концентрирования препараты этого бактериофага, достигающие титбам переноса генов микроорганизмов с помощью трансд тсции. Цель изобретения - повышение частоты трансдукции и упрощение способа. Для этого исполЬ- зуют фаг Р1 cml clr 100 ts pi, являющийся производным фага PI cml clr 100 ts, способного размножаться на культуре чумного микроба в слое мягкого агара на культуре клеток топ. Yersinia pestis с образованием негативных колоний при обработке клетокреципиентов полученным лизатом. Это обеспечивает получение без дополнительного концентрирования препаратов этого бактериофага, с титро м . 10 БОЕ/МЛ исключение ультрацентрифугирования фага исключение предварительной лизогенизации клеток до- Hopaj осуществление эффективной трансдукции по упрощенной методике. (Л ра 10 БОЕ/мл{ исключить ультрацентрифугирование фага; исключить предварительную лизогенизацию клеток донора и осуществлять эффективную трансдукцию по упрощенной методике. Способ осуществляется следующим образом. Получают фаголизат в результате рамножения фага Р1 cml clr 10.0 ts в слое мягкого агара на культуре клеток топ. Y. pestis, после чего обрабатьшают клетки реципиенты этим лизатом . Пример 1. Траисдукция arg- гена Y. pestis. Для приготовления трансдуцирующего лизата фаг Р1 cml clr 100 ts pi с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ социАлистичесних

РЕСПУБЛИК (g1)g С 12 Н 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

r10 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ пРИ гкнт ссо (21) 3858282/28-14 (22) 25.02.85 (46) 15,03,90. Бюл. М 10 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) М.И.Заренков, С.А,Лебедева и Г.К,Гуревич (53) 577.2(048)(088.8) (56) Лебедева С.А., Гуревич Г,К,, Заренков M.È., Милютин В.Н, Трансдукция у Y.pestis, осуществляемая бактериофагом Рl чсдп и Pl cml clr

IОО tr. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1984, М 2, с, 17-19, (54) СПОСОБ ТРАНСДУКЦИИ ХРОИОСОМНЫХ

МАРКЕРОВ И ПЛАЗМИД 7YERSINIA PESTIS (57) Изобретение относится к бактериальной генетике, а именно к спосоИзобретение относится к области бактериальной генетики, а именно к области переноса генов микроорганизмов с помощью трансдукции.

Цель изобретения — повьппение частоты трансдукции и упрощение способа.

Это достигается путем использования фага Pl cml clr 100 ts pl, который является производным фага

Pl cml clr 100 ts, способного размножаться на культуре чумного микроба в слое мягкого arapa с образованием негативных колоний, что обеспечивает возможность: получать без дополнительного концентрирования препараты этого бактериофага, достигающие тит„„SU „„) 304406

2 бам переноса генов микроорганизмов с помощью трансдукции,, Цель изобретения — повышение частоты трансдукции и упрощение способа, Для этого используют фаг Pl cml clr 100 ts pl, являющийся производным фага Pl cml clr

100 ts способного размножаться на культуре чумного микроба в слое мягкого агара на культуре клеток mon, Yersinia pestis с образованием негативных колоний при обработке клетокреципиентов полученным лизатом. Это обеспечивает получение без дополнительного концентрирования препаратов этого бактериофага, с титром .

10 БОЕ/мл1 исключение ультрацентрифугирования фага, исключение предварительной лизогенизации клеток до нора; осуществление эффективной трансдукции по упрощенной методике..ра 10> БОЕ/мл, исключить ультрацент- © рифугирование фага; исключить предварительную лизогенизацию клеток донора и осуществлять эффективную трансдукцию по упрощенной методике °

Способ осуществляется следующим образом.

Ж

Получают фаголизат в результате рамножения фага Рl cml clr 100 ts в слое мягкого arapa на культуре клеток mon. Y. pestis, после чего обраба- тывают клетки реципиенты этим лизатом, Пример 1, Траысдукция argгена Y. pestis.

Для приготовления трансдуцирующего лизата фаг Pl cml с1г 100 ts р1 с

1 304406 титром 10 БОЕ/мл смешивают по 0,1 мл с 18-часовой бульонной культурой

Y, pestis KV76, которая не нуждается в аргинине, выращенной при 28 С до концентрации 10 м,кл/мл. Смесь инкуо бируют при 37 25-30 мин и высевают в 3 мл 0,6 -ного агара.LB> которые затем выливают на поверхность 1,5Хного arapa LB. Чашку инкубируют сут- 1О о ки при 37 С, По окончании инкубации верхний слой агара (0,6Х-ного) собирают в центрифужную пробирку, добавляют 0,2 мл хлороформа, встряхивают в течение 3 мин, дают постоять при ком- 15 натной температуре 30 мин, Затем низкоскоростным центрифугированием (б000 об/мин, 15 мин) осаждают агар и остатки клеток, Надосадочную жидкость проверяют на стерильность высевом на питательный агар и в питательный бульон LB после чего используют как трансдуцирующий лизат, Титр полученного таким образом фага при проверке на газоне культуры Y. pestis EV76 обычно достигает 10 BOK/ìë, 3

Для проведения трансдукции смешивают по 0,5 мл 18-часовой бульонной . культуры arg-зависимого реципиента

Y, pestis EV76 (экспоненциальная фаза 10 роста) выращенной при 28 С и трансЭ 1 дуцирующего лизата (10 БОЕ/мл). Смесь инкубируют при 37 С 25-30 мин. Осаждают клетки центрифугированием (6000 об/мин, 15 мин) промывают физи- 35 ологическим раствором и высевают на плотную агаровую среду И9, содержащую добавки, необходимые для роста независимого от аргииина 7.резйхз ЕЧ76 .

Контролем служи посев на эту же 10 среду культуры реципиента, обработанной также, как с,пытная проба, но без добавления трансдуцирующего бактериофага, Посевы инкубируют при 28 С до появления трансдуктантов (обычно 56 сут), Частота трансдукции хромосомных генов составляет 10 -10 "/ÁÎÅ. На одной пластинке arapa вырастает от 10 до 100 трансдуктантов, Пример 2. Трансдукция плазми о ды RP4.

Трансдуцирующий лиэат готовят как описано в предыдущем примере, .I . используя в качестве донора культуру штамма Y,pestis EV76 (RP4/Тс Km Ap>) на которой размножают трансдуцирующий фаг. Смешивают по 0,2 мл этого лизата (10 БОЕ/мл) и реципиентной

18-часовой бульонной культуры штамма

Y.pestis Otten str, выращенной при

28 С. После инкубации смеси при 37 С в течение 30 мин по 0,2 мл ее высевают на 1,5Х-ный агар 1.В с тетрациклином (12,5 мкг/мл). Контролем служат посевы фаголизата на стерильность и бактерий реципиента на агаровую среду с тетрациклином, Выросшие колонии отсевают и после дополнительного рассева: на изолированные колонии проверяют по Ар" и Km маркерам плаэмиды

RP4. Частота трансдукции составляет

10, -10 /БОЕ, Пример 3. Контрансдукция

pro- u gua-генов, Трансдуцирующий лизат готовят как описано выше, размножая фаг на культуре донора Y. pestis Otten, прототрофного по пролину и гуанину 0,5 мл полученного лизата (10 БОЕ/мл) смешивают с 0 5 мл 18-часовой бульонной культуры реципиента У.. pestis Otten

pro gua str. После инкубации в течение 25-30 мин при 37 С клетки осаждают центрифугированием (6000 об/мин, 15 мин), промывают физиологическим раствором и высевают на два варианта минимального агара И9, необходимыми для роста реципиентами, исключая в одном варианте этой среды пролин, в другом — гуанин, Посевы инкубирун>т при 28 С 5-6 сут, Сформировавшиеся на обеих селективных средах колонии рассевают повторно на той же среде и затем по 2 выросшие колонии каждого трансдуктанта отбирают для проверки их зависимости от пролина и гуанина.

80Х колоний, выросших без пролина (частота их появления 10 /БОЕ) не нуждаются в гуанине, и наоборот, 80Х гуаниннезависимых трансдуктантов могут расти на среде без пролина, то есть частота совместной передачи этих двух маркеров составляет 80Х.

Использование во всех трех приемах Str " реципиентов при отсутствии этого маркера у донорных бактерий позволяет провести дополнительный контроль трансдукции: все трансдуктанты должны быть с этим маркером.

Для экспериментов по трансдукции у 7. pestis могут быть использованы как среды импортного производства на основе дрожжевого экстракта и пептона фирмы "Difco" (например, агар LB) так и отечественные качественных серий (типа агара Хоттигера).

В качестве минимальной среды приме, 1304406

Формула изобретения

Составитель H.Êóçåíêîâà

Редактор Х,Васильева Техред М.Ходанич Корректор Т.Малец

Заказ 992 Тираж 491 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по издбретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина, 101 няют агар М9, в общеизвестную основу среды М5 добавляют до 1,57 агар-агара и ° и

ВхЕсо или высокоочищенного качественного отечественного агар-агара и

5 для обеспечения роста бактерий Y pestis на 100 мл среды — 0,2 107-ного раствора серно-кислого магния, О, 5 мл

207.-ного раствора серно-кислого аммония, 0,5 г сульфита натрия, разведен- 10 ного в 2 мл дистиллированной воды, и

0,4 мл 407-ного раствора глюкозы, а также фенилал и метионин в количестве

0 1 мл 0,1 -ного раствора, по которым бактерии штаммов EV76 и Otten яв- 15 ляются природными ауксотрофами, Трансдукцию с помощью бактериофага Pl cml clr 100 ts pl можно эффективно проводить с любыми штаммами чумного микроба.

Время, затрачиваемое на проведение трансдукции, не превышает 24 ч, что в 3-5 раз быстрее, чем при использовании ранее применяемых фагов.

Появляется возможность проведения од— новременного множества опытов по

I трансдукции, используя в одном экс- . перименте несколько доноров и реципиентов, а не 1-2, как это позволяет принятая в практике для Y.pestis методика. Наконец, на пластинках селективных сред вырастает на 1-2 порядка большее количество трансдуктов, что способствует более эффективному сбору и анализу трансдуктантов при работах по контрансдукции, а также интенсификации работ по конструированию нужных для экспериментов штаммов.

Способ трансдукции хромосомных мар" керов и плазмид у Yersinia pestis путем обработки клеток реципиентов фаголизатом, отличающийся тем, что, с, . целью повышения час" тоты трансдукции и упрощения способа, лизат получают из фагов Pl cml clr

100 ts р1, выращенных в слое мягкого агара на культуре клеток Y.pestis.