Способ получения противоопухолевого средства

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

151) 4 А 61 К 39/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К FlATEHTY

%ИВ/.д0т .

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3278847/28-14 (22) 14.04.81 (46) 15,04.87. Бюл. 11 - 14 (71) Др..Мадаус унд Ко.(DE) (72) Герхард Пульверер (ВЕ) (53) 576.8.093.1 (088,8) (56) Патент Франции N9 2279416, кл. А 61 К 37/02, 1975. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО СРЕДСТВА путем выращивания микроорганизма-продуцента в питательной среде с последующим отделением биомассы и выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью снюкения побочных действий, проявляющихся при химио- и радиотерапии, в качестве

„,SU„„1304736 А3 продуцента используют штаммь: Propionibacterium avidum К-40, Propionibacterium granulosum К-45 или Propionibacterium acnes АТСС 6919, культивирование проводят при 34-39 С в о течение 48-100 ч в аназробных условиях, отделенную центрифугированием биомассу промывают, суспендируют в фосфатном буфере, очищают, отделяют цельные клетки центрифугированием и лиофилизируют, или после промывания биомассу дезинтегрируют в мельнице с помощью стеклянных шариков, последние отделяют, полученную суспензию клеточных стенок центрифугируют, седимент суспендируют в фосфатном буфере, очищают, затем центрифугируют и седимент лиофилизируют.

130 736

Изобретение относится к метл<цике а име1п!О к фармацевтической промьппЛЕН1<оr ТИ

Целью изобретения является снижение побо -<кых действий, гроя! !ляющихся при химио- и радиотерапии.

Спос.об осуществляют след(ющим об— разом.

П р и <; е р 1. Получение клеточных стенок., Жидкостное выращивание соответствующей пропионовой палочки осуществляют в 1-литровой колбе Эрленмейера и при 37 С в акаэробных условиях. (1л!! массового выращивания среду„

i аl!р

После культивирования в теч(-ние 72 ч рол» с TeêJiÿ Ill!le шарики Отделяют от

r0мО: с::пзат(1 с помощ lo G — 1 стеклshklo" го йил-тра с помощью фосфатпого буфе-ра (! /15 yl Na 11P0„. 2Н О } и (1/15 М

1С1. РО,, ),.

Молочку

-,0000!. и ;садок рас!1 оряют в фосфатном ". ;, (;! (.. (р11 2)

Лв "о:<и 1." 1(ские <фермекть. 1!нактиви руют в течение 10 мин кипячением на водяной бане.

Кле to I!; le стенки очищают путем инкубаllHH при <7 С в Te÷åíèe 24 ч в с псмошью

Очгппс<гкые пу ем трипсигп о го перевариьания клеточные стeHKH iiekITpH фугируют при 40000 g в течение 30 мин

H IIpoMLILaloT 3 раза дистиллированнои водой. затем высушивают вымор аживанием.

+/А-бульон, r:

Bacto Gasitom

Bacto yeast экстракт

17

КJIPTI(H Отделяют От жидкости путРм цс!трифутирования нри 10000 д в те-чение 20 мин в центрифуге с охлажденHe! „Ссадо -. промывают Три!!(<<ы дистил-л ровакной водой и затем смешивают ц!.;Ой;!ым О .ъe . to< .I "тpK. !янных !париков циаме рo!! О,! 7-0, 18 мм и измельчают ь клет<-чной мельнице в течеl-"èå 1р 5 ч . Пo c le мгп(роскопичРc ((! ÃО конт

КН.,РО, 4 1gS0, 7Н,0 1

Глюкоза 4

Дисти

Фосфатный оуфер 1/15 1 1 1<1а НРО х

2. 2Н О и 1/15 11 КН РО < растворяют каждый в 1000 мл дистиллированной воды, 613 г раствора. вторичного фосфата натрия смешивают с 388 г раствора первичного фосфата калия и устанавливают рН 7„.2.

Пример 2, При.готовление суспензий P. асгев (штамм АТСС 6919), P, oniolum (штамм 0575, KP) и P. granulosum (штамм KI 45).

Лиофилизирсвакные по примеру 1 пропионовые палочки указанного вида суспендируют в буферированком фосфатным буфером рас.творе поваренной соли указанного вива в коннентрации 5,0 или 7,5 мг/мл„ 1 олученная суспензия пригодна в основном для интраперито25 неальной инъекции.

Пример 3. Согласно примеру

2 готовят вводимые путем интраперитокеальной инъекции суспензии штамма

Р. granulosum (KP 45, 95 К), штамма

Р, acnes (АТСС 6919) и п.тамма Р, oniОТ(!и! (0575, КР 401 мз лиофилизированного матери,"=а с :(Ояц(нтрацией 5 или

7, 5 мг/мл кле To lklo=o материала.

Пример 4. Приготовление ввод!!мь!х икъекций суспензий для дополни гельного лечения (oáðàáoòêH) при химиотерапии.

111тамм Р, gl anuТо;um (KP 45) готов;!т согласно:1ри<мер 1, Приготавливают суспензию 30 мг клеточного материала в 100 мл раствора для внутривенного введения.

Исследования ик пиво .

1. Гемопоэз (кроветворение) у обработанных пропионовыми палочками мышей после лeòàëükloão сблучения, IpH штамма проиионовых палочек (Р„ аспез, P. rànul.osum, P. oniolum) в дозе 1,5 мг на мьшь вводили путем ик -раперитонеалькой инъекции леталь—

ll(Облученным мышам (850 P). При этом получили„ что Р. granulosum бс>льше всего удлиняет время переживания облученных мьппей, Используют взрослых самцов мьпней штамма Swiss в возрасте 8 недель. ." животных кормят по стакдартной диете, Воды дают вдоволь„ Ьоцу и корм сте1304736

Исследование экзогенных селезеночных колоний.

3а 3,2 или 1 день до трансплантации костного мозга мышам-донорам вводят путем инъекции 1,5 мг P, granulosum. Готовят суспензию клеток костного мозга путем промывки обеих бедренных костей стерильной Раг1сегсредой. Клетки подсчитывают в гемоцитометре. 5 10 способных размно5 жаться клеток в 0,2 мл Parker-среды вводят путем инъекции в хвостовую вену каждой мьппи. Мышей зя 4 ч до трансплантации костного мозга облучают 850 P. Контрольным мьппам вводят путем инъекции 0,2 мл среды или

5 10 клеток костного мозга нормальных мышей (не обработанных P granulosum). Другой группе мышей-доно-ров вводят как указано выше P. granulosum, затем животных анестезируют эфиром, из ретробульбарного сплетения берут кровь. Клетки крови подсчитывают в гемоцитометре и аликвотные части крови с 5 10 нуклеированных клеток вводят путем инъекции в хвостовую вену облученных дозой 850 P мышей. Контрольные мьппи получают такой же объем крови, который взят у нормальных мышей (не обработанных

P. granulosum). Всех мьппей умерщвляют спустя 9 дней после трансплантации крови или костного мозга и взвешивают, вынимают селезенку, снова взвешивают и определяют число колоний на селезенку после фиксации в смеси хлороформ — этанол 1:3 °

35 рилизуют. Водя содержит окситетрацикпин (1 г нл 1000 мл), Мышей облучлют во вращающейся метлкриплтной клетке по 10 мьппей на кле ку при удалении нл 50 см от ТСХ

250 — Medicor-единицы, которая работает при 200 кВ и снабжена 0,5 мм

Си-фильтром, 650 или 850 P Скорость облучения 75 Р/мин определяется СТ-1 термолюминесцентного К-дозиметром. 10

Для экспериментов применяют штамм

P. nenes (АТСС 6919), штамм P. oniolum (0575, KP 40) и штамм P, granu1овип7 (КР 45) в форме умерщвленных целых клеток и в форме клеточных сте- 15 нок. Лиофилизированные пропионовые палочки суспендируют в фосфлтбуферном растворе поваренной соли концентрацией 7,5 мг/мл и вводят путем инъекции 0,2 мл суспензии интраперитоне — 20 ально (!,5 мг на мышь).

11ссчсдов 7!.17t :7I!j1(7I е! 17ых сc (cзе ночных копоний.

За 3,2, 1 ипи 0 .И ей до облучения дозой 650 Р II;!ll!aì интрлпсритонелльис вводят путем инъекции Р. г,гаl!ulosum.

Контро:IIlliie 7.пппи попучлют тлкои же объем PRS (бу ферирс глнный фосф;ггоь7 раствор повлреннс:"-; co„!Il). Спустя

9 дней после обпу ic!гия животных умер7пвляют и вьп имлк7т селезенку, взвешивают и подсчитывают колонии, Kaê и в случае !Ipåäi-Iäóùeãо тестл, для онределегп я экзогеннь7х селезеночных колоний.

Тест нл выживлние.

Мышей разде:!яют !!ë 7 1 ру)1!i причем распределяют по 15 млш7ей i:a группу и облучают дозсй 850 P. Спустя 4 ч после облучеьп7я животным вводят путем инъекции клето и:ые стенки пгспио7овых папочек или цепь7е клетки. Ko: трольные мыши пол" чают такой 7„ 2 обьс м

PBS. Поличествс переживгllIK кинотнспх в каждой группе подс п|-.ывлют нл !О-й день после облу- ci::aÿ, Все три штамма пропиононых и;77очек приводят по срлa1!CFIIIII7 с контропьными животными к зня -и-. сльному удлинению7 переживания. P. granuloпромежутков

suIll в форме и в форме п преп;.рата из пелых клеток репарата из клеточных стее чем P. лсг.ез и P, avio— нок активне

lum.

В табл.

nulosum на колонии (шт

1 показ Iln в:.няниe P . дг а

ЭНДОГC!ГНЫС СЕЛС:-.ЕИС7 ИНЫЕ амм ЕР 45) .

Относительнь7й ьес селезeнки обпученных мышей уse:II!÷èвлетcF! только тогда, когда Р. granulosum вводят зл 1 день или спиc!ÿ 4 ч после обчучения дозой 650 P..

Число экзогенных селезеночных ко— лоний значительно ; величиьлется спучяе всех обработок.

В табл. 2 показано действие

P. granulosum ня образовлние эк огенных селезе o ных колоний (штамм

КР 45 7 .

Не установлено различия в относительном весе селезенки между мышами, которым трансглантируют нормальный костный мозг и которым транспллнтируют костный мозг обработанных P.granulosum зя 2,3 или 1 день до трансплантации животнь:х-доноров.

Обработка приводит к значительному снижению количества экзогенных

1304736

50 вой активности этих иммуностимуляторов.

P. granulosum ведет к регрессии более чем 707 в случае исследованных опухолей саркома-180, когда он вводится внутриопухолево.

Ин виво цитостатическая активность в случае Murine опухолевых клеток благодаря P, granulosum.

Изучают цитостатическое действие штамма Propionibacterium granulosum

KP 45 в случае саркомы L-1 у BAL

В/с-мышей (легкие).

Отмечается значительная активность по сравнению с необработанными животными.

Антибактериальное действие как дополнительная обработка при химиоте— рапии первичной или вторичной опухоли легких, Выбирают 30 пациентов с первичными или вторичными метастатическими опухолями легких. 10 пациентов путем внутривенного вливания получают

30 мг P. granulosum в 100 мл раствора для внутривенного введения. Другие 20 пациентов являются контрольными.

Всех пациентов лечат химиотерапевтически для синхронизации пролиферации неопластических клеток. Каждый курс длится 3 дня. 1-й день: винкрустин 1,5 мг внутривенно в 8 ч и в

20 ч; 2-й день: метотрексат 25 мг внутримьппечно в 20 ч; 3-й день: метотрексат 25 мг внутримышечно в 8 ч, также осуществляли введение метотрексата внутривенно до 25 мг в 14 ч и вливание 30 мг/кг циклофосфамида в то же самое время. Это химиотерапевтическое лечение осуществляют трижды 21 день.

Общая химиотерапия состоит из трех вьппеуказанных циклов, которые начинают на 1-й, 22-й и 43-й день.

Во время 3-ro 10-го, 31-r o u

52-го дня наблюдения вводят P. granulosum в дозе 30 мг/100 мл раствора для внутривенного введения в течение 15 мин (в последний день первого химиотерапевтического цикла и затем спустя 1 неделю по окончании каждого цикла).

В сгтучас обработанных только хи— миотерапевтически пациентов обнаружено 5 случаев бактериальной инфекции 1три пневмонии, один сепсис и ! случай ангины в течение 60-дневного времени наблюдения, в то время как в случае 10 обработанных с помощью химиотерапии и внутривенных введений (вливании) P. granulosum пациентов не обнаружено никаких симптомов бактериальной инфекции.

Толерантность пациентов по отношению к внутривенным вливаниям

P. granulosum m ai a KP 45 xopomas.

Во время вливания в количестве 30 мг

P. егапц1озитп наступают ощущения холода и затем повьппение температуры до 39 С (2 — 12 часов спустя после о вливания), которые на следукнпьз, день исчез ают .

Повторные вливания P, granulosum не приводят к развитию замедленной гиперповышенной чувствительности в течение 60-дневного наблю ения. Внутривенное вливание 30-240 мг P. granulosum — штамма КР 45 можно осуществлять без риска новых побочных действий или осложнений у пациентов.

Общая инструкция для локального введения (рак желудка и кишечника)

10 мг лиофилизированного продукта суспендируют в 1 мг 17.-ного раствора ксилокаина в растворе поваренной соли и вводят путем внутриопухолевой инъекции через кожу (диаметр 1 мм), причем применяется длиной 80 см жесткий полиэтиленовый отвод с прочно расположенной внутримьппечной иглой (18

bauge) без "-пифиза. Отвод через биоптический канал ьводят B эндоскоп (гастрофиброскоп или колоноскоп), причем пунктируют (прокалывают) находящуюся под визуальным контролем неопластическую опухоль и иглу вводят на 0,5-1 см в опухолевую ткань.

Продукт вводят путем инъекции через отвод и промывают 1-2 мл 17-ного ксилокаина в растворе поваренной соли.

Внутриопухолевые инъекции 10 мг продукта делают в течение первых трех дней, затем на 10-й и 17-й день наблюдения.

130473F) I0

Т а б л и

Количество эндогенных селезеночных ко!!с1!и!(у мышей,, которые обрабо га и

:- гop!oг, Ьа, бегiиш агапulosum — в тамм Кр 15 (среднее значение - стандар Iiioe отклсне1!Ие,!

G T !1 о с и т е- льный Б е с с. е i s е 3 е и к и

Число эндо! енных колоний селезенки!

, т а» ."! м

1(О н т !э о л!» ((» 5 0 l ) 1,.82 s- 01,45

1,24 0,67, „4.

4,- 5

1,66 - 0г24

10,6

8,17 + 3,49

1, (л !! 1!о с бл»7 ч е- s!fs за де1!ь до аблу!енин

+ 5,30

11,2

+ 4,70

I (11;УС - S ... »! -»О -;т - О»(»Л-»УЧЕ;-1И(!

?, 1? 0,38

14,1 l» 0» 0 II!

Таблица

,(osl.-, :ество зкзагенных колоний после трансфузни костного мозга от обработанных

1, !;; ssi s.sm - штамм !(Р 45 иьш -1!,среднеs значение + стандартное отклонение) (:F 11-S на I O! Относительный

Число экзогенных колоний нукленроваыных клеток вес селезенки костного мозга

II„l2 > !3,32

О 99 „О !с!

2О,4 + 2,14

l,,52 + 0,31!

О>с :1ми,.;азт 1-;aо1 !ельнь".:.; 1ьш!ен

IОЗ,О «+ 1Вр7

1,51 + 0,4sI

11г6 + ll6,О + 44„2

Костный »оэг мышей., который за

1 д,=ив дО - Оа sS 1 óSs=.!» бЫЛИ Q(»ра

1О7 О + 43!

0„,7 е- 4,3

1,69 0„27, О

s7. Огап1!1 osum эа 3 дня до облучения (,-, с-гны11 но з s- мышей 1;о торы! 3 а

3 д1я д:-. --рансМзии были обработаuû Р. Clanulosum

I(ss т1;:ь- ;- »:.:o = г .!рдей . котора:,е бы.

» х " о б р ас. о т а 11 ы Р» g s" агш::.».=: цп1 дн!! дс транс;!!уэии

1,73 0,21, 1 8:. . 0, .4 2

ll 2«+3,2

204,0 + 21,4

I 304736

Таблица Э

Число экзогенных селезеночных колоний после трансфуэии крови от обработанных

P. granulosum — штамм КР 45 мьппей (среднее значение + стандартные отклонения) CF W-S

6 иа 10

Относительный вес селезенки

Трансфуэия нуклеированных

3,8 Z 2,2 I,I7+0,28

1,4) + 0,23

6480

Кровь нормальных мышей

Кровь мьппей, которые эа 3 дня до трансфузии обработаны

P. granulosum

9,16 + 1,4

Ф

1,84+0,3) 2,62 + 0,88

9960

Кровь мышей, которые эа 2 дня до трансфузии обработаны

P. granulosum

l0,2 + 2,6 2,01 0,34

3,45 «+ 1,8 .

10120

Кровь мьппей, которые за 1 день до трансфузии обработаны

Р. granu osum

ФФ

1,54+0,23

««

74 «+ i Ь

3,23 + 1,48

9650

Таблица 4

Переживание пораженных саркомой-180 CFW-мышей при обработке пропионовыми палочками (1 мг/мьппь) на О-й, 4-й, 8-й, 12-й и 16-й день после имплантации опухолевых клеток

День после имплантации опухолевых клеток

Г Т T

Введение

28 30 32 34 36 38 40 42 44

Контроль

P. granulosum

15 13 10 7 3 0

Интраперитонеально P ° acnes

)5 15 15 15 12 12 10 9 9 7 6 5 3 3

Интраперитонеально P. aviolum

15 15 15 15 15 14 12 8 8 8 5 . 5 2 l

15 15 15 14 14 )3 il 10 8 5 4 4 0

Внутриопухолево

P. acnes

)5 15 15 15 15 15 13 12 )1 9 7 7 6 3

Внутриолухолево

P. aviolum

15 )5 15 15 15 14. 12 )1 9 7 7 7 5 2

15 15 15 15 15 15 )4 13 10 8 8 6 4 3

Внутриопухолево

« р с 0,01

-р с 0,05

Интраперитонеально P. granulosum

Лейкоцитоз в трансфундированной крови

Число экэогенных селезеночных колоний клеток костного мозга

1304736

1 /

Т;: б л и ц

Масса опухоли и число регредкрованных опухолей в случае поражен "ь|х саркомой — t 80 мьппей „которые были обработаны пропионовыми палочками (1 м ./мьппь,: на О-й, 4- 8-й, i 2-й и 16-й день после имплантации опухолевых клеток

Интраперкто.неальна.-". инъекция

Вн 7триоп ч хол6 Raÿ инъекция

Процент

1 Число

l per peМасса Чк сл о

1цт амм ., опухоли

1 ф регресдироваHный ог.-ухолей сик

2631 321 0/15

26314 32; 0 !

Контро, ь

Ртор о-.гЬасгеггшп

Rãaï.ë i он цгп

51 3 538 .212 11/15

842= 312 8/15

73,3

Ртор:1.оп 1.1» .с Еег:шп

4 i. 0 842+246 10/1 5

032 381 6/15

66,6

ov=о < u:.

Ртор1оц1 оасге 1шп эгле s

33,3 731 .218 9/15 ;. 26 4, 2,./1

60,0

Корректор М. Самборская

"aêaç 1325/58 гираж 596 Подпксное

ВНИ|ПИ Государственного комктета СССР по делам и.-;обретений к открытий

113035, Москва, Ж-35, Раужскas наб,, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 Ip I II,е н т р е. 1- p p ссик ! !

Сос-.ави..ель Е. Ярных

Редактор А,:1ежнкна .ехред Б,Кадаропухоли регре( г дкрс-!

t ванных !

| опух о, леи