Способ получения изолированных клеток печени

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине. Целью изобретения является увеличение выхода жизнеспособных клеток печени с повышенной степенью сопряжения дыхания и фосфорилирования. Предложенный способ получения изолированных клеток печени заключается в том, что извлекают печень декапитированного животного, после перфузии органа растворок енкса без кальция и глюкозы, затем печень разрезают на кусочки размером 1-3 мм и осуществляют дезагрегацию путем вибрации частотой 50-90 Гц в течение 30-90 с. Данный способ позволяет получить 98% жизнеспособных клеток печени (при общем количестве 58 млн. клеток на 1 г печени) с высокой степенью сопряжения дыхания и фосфорилирования (отношение скорости эндогенного дыхания, стимулированного разобщителем 2,4-динитрофенолом, к скорости эндогенного дыхания составляет 4,2). 4 табл. (Л U ю у

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

А1 (19) (11) о 1) 4 С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОбРЕТЕНИЯ 13, ) гч,- ..., Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3949496/31 — 13 (22) 17.06.85 (46) 15.05.87. Бюл. Р 18 (71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР (72) А.Х.Белоус, H.Ï.Ñóááîòà, А.10.Петренко и А.Н.Сукач (53) 578.085.23(088.8) (56) Канаева И.П. и др. Дыхание и окислительное фосфопилирование в изолированных клетках печени. — Цитология, 1975, т. 17, Р 5, с. 545-551. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ

КЛЕТОК ПЕЧЕНИ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине. Целью изобретения является увеличение выхода жизнеспособных клеток печени с повышенной степенью сопряжения дыхания и фосфорилирования, Предложенный способ получения изолированных клеток печени заключается в том, что извлекают печень декапитированного животного, после перфузии органа раствором бенкса без кальция и глюкозы, затем печень разрезают на кусочки размером 1-3 мм

2 и осуществляют дезагрегацию путем вибрации частотой 50-90 Гц в течение

30-90 с. Данный способ позволяет получить 987. жизнеспособных клеток пе— чени (при общем количестве 58 млн. клеток на 1 г печени) с высокой степенью сопряжения дыхания и фосфорилирования (отношение скорости эндогенного дыхания, стимулированного разобщителем 2,4-динитрофенолом, к скорости эндогенного дыхания составляет

4,2) ° 4 табл.

0426

Т а блица 1

Способ

Количество клеток, млн

Количество неповрежденных гепатоцитов (7 от общего количества клеток) из 1 г печени из органа

Известный 50,0+2

240+40 92+1,2

Предлагаемый

58,0+2

586+17 98+0,4

Таблица 2

Способ

Энд

Известный

8,1

18,3

4,3

Предлагаемый 2,32+0,3 10,9+0,9 4,8+0,3 4,2

1,8

1 131

Изобретение относится к биотехнологии, и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине.

Цель изобретения — увеличение выхода жизнеспособных клеток печени с повьш>енной степенью сопряжения дыхания и фосфорилирования.

Способ получения изолированных клеток печени иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Вскрывают брюшную и грудную полости декапитированной крысы массой 200 r,-íèæíþþ полую вену перевязывают вьппе места ответвления правой почечной вены и перевязывают дистальнее лигатуры, нижнюю полую вену надсекают в месте впадения ее в предсердие. В просвет сосуда вводят инъекционную иглу и с помощью перистальтического насоса проводят промывание печени 200 мл промывного раствора Хенкса без кальция и глюкозы. Печень извлекают из грудной по-. лости и разрезают на кусочки размером

1-3 ммЭ, затем переносят в сосуд устройства, содержащий 10 мл раствора состава 250 мМ сахаровы, 5 мМ КС1„

0,4 мМ КН РОд, 0,4 мМ 1>1аН>РО, 2 мМ дитиотреитола, 1 мМ ЗДТА, 0,8 мМ

NgC1> и 17 альбумина. рН раствора 7,4.

Далее включают электродвигатель и дезагрегируют кусочки печени при «озвратно-поступательном движении пестика с частотой 50 Гц и амплитудой

5 мм..

Дезагрегирование осуществляют в течение 60 с. Полученную суспенэию клеток фильтруют через 4 слоя нейлона и осаждают при 1500 об/мин в течение 1,5 мин. Полученные клетки дважды промывают раствором.

Жизнеспособность клеток определяют по 0 27. — ном растворе витального красителя трипанового синего.

Подсчет жизнеспособных клеток осуществляют в камере Горяева °

Результаты опытов по определению выхода жизнеспособных гепатоцитов

У представлены в табл. 1. Выход жизнеспособных клеток п = 7o

Данные, представленные в табл. 1, показывают, что выход жизнеспособных клеток печени по предлагаемому спо30 собу увеличивается íà 67 по сравнению с известным.

Сопряженность дыхания и фосфорилирования исследуют полярографически, определяя скорость эндогенного

35 дыхания (Ч ), скорость эндогенного

Э й4> дыхания, стимулированного разобщителем 2, 4-динитрофенолом (V ДНФ), скорость окисления сукцината-субстрата в норме не проникающего через плазматическую мембрану (V „„).

Результаты опытов по эффективности окислительного фосфорилирования получаемых клеток печени представле45 ны в табл ° 2 ° (Сопряжение окисления и фосфорилирования n = 6).

VcvKu, VANE / суки, /

/V9HA /79яд

Таблица 3

Выход клеток из ткани, млн

ЖиэнеспособВыход жизнеспособВремя воздействия ность

X ных клеток на 1 гпечени, млн

30 98+2 40,0+4,8 320,0+38,4

90 97+3 44,0+5,4 352,0+26,2

Таблица 4

Функциональная активность (ХДНФ/Чэнд) Выход жизнеспособных

ЖизнеспособЧастота вибрации, Гц

Выход клеток из ткани, млн ность, 7 клеток на

1 г печени, млн

70 98+2 58,2+7,4 576+72

90 98+2 56,8+7,2 537+64

4,1+0,5

4,0+0,4

Формула и з обретения повышения выхода жизнеспособных клеток с повышенной степенью сопряжения дыхания и фосфорилирования, дезагрегации подвергают предварительно измельченную печень, а дезагрегацию проводят с помощью вибрации с частотой 50-90. Гц в течение 30-90 с.

Способ получения изолированных клеток печени путем извлечения органа, его перфузии, дезагрегации и отделения целевого продукта, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью.Составитель M.Ñåðoâà

Техред M.Õîäàíè÷ Корректор С.Иекмад

Редактор И. Сегляник

Заказ 1868/26 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 13104

Данные, представленные в табл. 2 свидетельствуют, что полученные клетки характеризуются прочным сопряжением процессов дыхания и фосфорилирования (отношение V нф/Väцд равно 4,2, что в 2,2 раза выше, чем в известном способе). Косвенная оценка проницаемости плазматической мембраны клеток по скорости окисления непроникающего субстрата сукцината свидетельствует 10 о меньшей проницаемости плазматической мембраны по сравнению с известным способом (отношение Ч „ /Ч „„ равно

1,8 по предлагаемому и 1,3 по извест. ному способам). 15 Пример 2. Способ осуществляют, как описано в примере 1. Время

26 4 дезагрегации 30 с и 90 с, а частота вибрации 70 Гц и 90 Гц.

Результаты исследований представлены в табл. 3-4.