Способ определения пирувата в биологических объектах

 

Изобретение относится к биохиъши: и биотехнологии и обеспечивает повышение стабильности и достоверности результатов определения за счет предотвращения образования осадков и помутнений . Способ заключается в том, что в состав реактива для определения целевого продукта входит пируватоксидаза, характеризующаяся оптимумом активности при рН 5,7, оптимумом стабильности при рН 5,6-5,8, константой Михаэлиса для пирувата при 25 С 0,4 ммоль/л, для фосфата 2,3 ммоль/л, мол.м 146000 дальтон при определении в центрифуге по , вьщеленная из штаммов мелочно-кислых бактерий Са ctobacillus DSM 2671, Lbc. salivari- U8 DSM 2573, Leuconostoc mesentero- ideB DSM 2572 и/или Streptococcus creraoris DSM 2574. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОЮ (1II

3 Г ",Ill". > .

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

1 вГ г r

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3706215/28-13 (22) 24.02.84 (31) P 33067198 (32) 25.02.83 (33) DE (46) 07.07.87. Бюл. В 25 (71) Берингер Маннхайм ГМБХ (DE) (72) Эрих Элстнер, Карл-Хайнц Шлейфер, Фридрих Гец, Барбара Зедевиц, Альберт Редер, Ханс Меллеринг и Ханс Зайдель (DE) (53) 577. 15(088.8) (56) Патент ФРГ Ф 291148 1, кл. С 12 D 13/10, опублик. 1979. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИРУВАТА В

БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ (57) Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и обеспечивает повы 4 С 12 0 1/26, С 12 N 9/04// (С 12 Q 1/26, С 12 R 1:01) шение стабильности и достоверности результатов определения за счет предотвращения образования осадков и помутнений. Способ заключается в том, что в состав реактива для определения целевого продукта входит пируватоксидаза, характеризующаяся оптимумом активности при рН 5,7, оптимумом стабильности при рН 5,6-5,8, константой о

Михаэлиса для пирувата при 25 С

0,4 ммоль/л, для фосфата 2,3 ммоль/л, мол.м 146000 дальтон при определении в центрифуге по А, выделенная из штаммов молочно-кислых бактерий Еа

ctobaeillus DSM 2671, ЬЬс. salivarius DSM 2573, Leuconostoc mesentего- I

ides DSM 2572 и/или Streptococcus

cremoris DSM 2574. 4 табл.

132298

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и касается получения фермента, пригодного для количественного определения пирувата и пируватобразующих ферментов. 5

Цель иобретения — повьш ение стабильности и достоверности результатов определения за счет предотвращения образования осадков и помутнений.

Способ определения пйрувата в био- 10 логических пробах заключается в том, что в состав реактива для определения пирувата входит фермент пируватоксида, активный беэ добавления флавинадепиндинуклеотида (FAD) тиамин-пирофосфата (TPP) и двухвалентных ионов металлов. Пируватоксидаза оптимально активна при рН 5,7, оптимально стабильна при рН 5,6-5,8 и, что особенно важно, при применении фермента кон- 20 станта Михаэлиса равна 0,4 ммоль/л для пирувата и 2,3 ммоль/л для фосфата, мол.м. фермента 146000 дальтон, что меньше известного фермента (190000).

Полученный фермент более специфичен к субстрату по сравнению с известным.

Характеристики специфичности представлены в табл. 1.

Влияние ингибиторов на активность предлагаемого фермента, используемого для определения пирувата, показано в табл.2.

Ингибирующее действие ЕДТА на предлагаемую пируватоксидазу в 1000 раз слабее, чем в случае известного фермента, а после многодневного диализа фермента благодаря добавке ТРР, 40

FAD и Мп активность повышается на

5-157., в то время как известный фермент без этих активаторов неактивен.

В качестве источника фермента используют штаммы молочно-кислых бак- 45 терий Lactobacillus plantarum 0БМ

2571, ЬЬс. Salivarius DSM 2573, Leuconosboc mesentегоides DSM 2572 и/или Streptococcus cremoris DSM

2574, хранящиеся в Национальной коллекции микроорганизмов.

Обогащение и очистку фермента осуществляют обычными биохимическими методами. Можно достигнуть 20-30-кратного обогащения до достижения удельной активности 6-9 ед/мг протеина.

Полученная пируватоксидаэа входит в состав реактива для определения пирувата в анализируемых пробах.

4 2

Предпочтительный состав реактива:

1-50 ед/мл пируватоксидазы, 10

50 ммоль/л фссфата, буфер рН 6-8 (любое пригодное буферное вещество, буферирующее в указанных рН-областях, в которых фермент активен и стабилен). Хорошо пригоден фосфатный буфер и 0,22 ед/мл пероксидаэы (РОД).

Использование в составе реактива предлагаемого фермента обеспечивает более высокую способность его к хранению.

Выделение пируватоксидазы (Py-OD) из Lactobacillus plantarum DSM 2571 осуществляется следующим образом.

1. Культивирование. Среда для культивирования содержит, г/л воды: бакто-триптон-оксоид 10;дрожжевой экстракт оксоида 4 К НРО х 3 Н О 2; диаммоний-гидроцитрат 2; 80 (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат)

1 мл; MgSO4 х 7 Н10 0,2; MnSO x х Н О 0,2; сульфид молибдена 0,2; лактоза 10; пировиноградная кислота

3,2; рН 7.

150 мл среды указанного состава или обычной для бактерий молочной кислоты MRS-среды засевают культурами путем укола и встряхивают при

28 С. После происшедшего роста

150 мл указанной среды засевают 15Х выращенной культуры и встряхивают в колбе Эрленмейера емкостью 500 мл при о

28 С вплоть до завершения поздней лаг-фазы.

MRS-среда составляется следующим образом, г/л: мясной экстракт (MERCK) 2; пелтон из казенка 10)

trypish дрожжевой экстракт 4; глюкоза 20; твин-80 1мл; К НРО4 "3 Н О

2,5; Na-ацетат х 3 Н О 5; диаммонийцитрат 2; MgS04 х 7 Н О 200 мг;

MnSO х Н О 50 мг.

2. Выделение. Из 50 л культуральной жидкости Lactobacillus DSM 2571 со 120 ед/л пируватоксидазы (Ру-OD) собиают 300 г влажной массы путем центрифугирования. 100 г клеток помещают в стеклянную диномельницу, после добавки 4Х полиэтиленимина центрифугируют и надосадочную жидкость обрабатывают фракционированием сульфатом аммония (25-657) при рН 6,3, хроматографированием с помощью декстранблау-сефарозы (фирма Farmacia), второго фракционирования с помощью сульфата аммония при 20-ЗОЖ (насыщения) и путем пропускания через мо1322984 4

Очищенный фермент имеет удельную активность 5,8 ед/мг и содержит менее чем 0,03Е Аро-глутамат-пируваттрансаминазы + < -кетоглутаратоксидазы, а также менее 0,002X. NADH-ок- !О сидазы.

Активность пируватоксидаэы определяют при следующи:: условиях: пируват + P, т От Р» — 00 ацетип!

H O + 4-аминоантипирин (4-AA) +

+ 2 окси-3,5-дихлорбензол сульфокислота (HDBS) POD хиноновый краситель (546 нм) + 2 Н О.

Н 3 потребляется эквимолярным ко-2р личеством красителя.

1 ед. Py-OD 1 мкмоль превращеО ния пирувата в 1 мин при 25 С.

Определение пирувата: 72 ммоль калийсофатного буфера, рН 6,7; 25

8 ммоль 4-AA 6,8 ммоль/л HDBS;

0,01 ммоль/л FAD; 2 ед. POD; 10 ед.

Py-OD на 1 мл. Старт для последовательности до целевого значения осуществляется путем добавки 0,05 мкмольЗО пирувата, соответственно содержащей пируват-пробы, в кювету объемом 2 мл при толщине слоя 1 см и температуре

37 С.

Реакция спустя 15 мин прекращаеt-я 35

Коэффициент экстинкции при 546 нм

16,5 см (мкмоль измеряется для чистого пирувата — мононатриевая соль).

Пример 1. Кинетическое определение пирувата (GPT).

K 2,5 мл раствора, содержащего, ммоль/л: КН РО (рН 6,7) 80; алании ! I

800; N-(3 -сульфонил-4-окси-5 -хлор- 45 фенил)-4-аминоантипирин 0,2; са -кетоглутаровая кислота 18, а также пируватоксидаза 0,2 ед/мл; пероксидаза 2 ед/мл, добавляют 0,1 мл пробы.

Спустя 3 мин определяют изменение 50 экстинкции в 1 мин. Температура измеО рения составляет 25 С, длина волны

546 нм, E составляет 19,6, общий объем 2,6 мл и объем пробы 0,1 мл. Иэ прироста экстинкции в 1 мин рассчитывают активность íà GPT.

П р и и е р 2. Кинетическое определение GOT. В исходную смесь, аналогичную примеру 1, которая вместо ала3 лекулярное сито Сефадекс АСА (фирмы ЬКВ)

Данные обогащения представлены в табл .3. нина содержит 200 ммоль/л аланинсульфиновой кислоты, в тех же условиях, как и в примере 1, добавляют GOT-содержащую пробу. Из иэмедения экстинкции в 1 мин рассчитывают содержание

GOT.

Пример 3. Тест-полосы для

GPT.

Для приготовления тест-полос GPT пропитывают две бумаги.

Ферментная бумага: 0,5 моль/л морфолинэтансульфокислота (гидроксид калия, рН 6, 5 (MORS-буфер); 800 ммоль/л аланина; 1 ммоль/л гидрофосфата калия; 20 000 ед/л PBD; 200000 ед/л пируватоксидазы.

С помощью этого раствора пропитывают адсорбирующую бумагу толщиной

50 ммк, с поверхностной плотностью

12 г/и, поглотительной способностью

50 г Н О/м, и высушивают в течение

5 мин при 30 С (например, ситчатая бумага для чая Teebeutelpapier фирмы

Scholler and Hosch). Бумагу затем разрезают на полосы шириной 1 см.

Индикаторная бумага: !О ммоль/л

4,5-(4-диметиламино-фенил)-2-(3,5-диметокси-4-оксифенил) имидазола и 18 ммоль/л -кетоглутаровой кислоты растворяют в 100 ммоль/л НС1 (буферная система).

С помощью этого раствора также пропитывают соответствующую адсорбирующую бумагу, высушивают в течение

О

5 мин при 30 С и разрезают на полосы шириной 1 см. Прозрачную поликарбонатную пленку толщиной 10 ммк вместе с индикаторной бумагой и ферментной бумагой наносят с одной стороны на пластиковые полосы (ленты), укрепляют так, что пленка прилегает снаружи, индикаторная бумага в середине, ферментная бумага внутри ° Наряду с этим наносят шириной 15 мм прочес из стекловолокна, толщиной 1,5 мм, с толщиной волокон примерно 2 мкм, так что свободный конец пленки и пропитанная бумага выступают еще на 6 мм над прочесом (ваточным холстом). Затем все разрезают на тест-полосы шириной 6 мм. Если наносят 15 мкл цельной крови на участок для нанесения пробы, то в течение 45 с доля плазмы проникает через стекловолокнистый прочес под прозрачную пленку, в то время как эритроциты удерживаются на месте нанесения. После прижатия пленки ферментная и индикаторная бумаги

1322984

Таблица 1

Субстрат

100

100

Пируват е -Кетобутират

Ацетальде15 гид

Метилглиоксаль

20 соприкасаются с освободившейся плазмой и равномерно увлажняются. Содержащийся в плазме пируват (GPT) реагирует с синям окрашиванием, интенсивность которого пропорциональна коли- 5 честву (измерению) GPT и при известных условиях может измеряться в ремисснонном фотометре. Таким же образом реагируют другие испытуемые материалы, такие, как сыворотка, плазма и т.д.

Пример 4. Тест-полосы Hà GOT.

Тест-полосы на GOT готовятся так же как и полосы íà GPT согласно примеру 3, тоЛько в ферментиой бумаге вместо аланина содержатся 200 ммоль аланинсульфокислоты. Получающееся после прнкатия прозрачной пленки синее. окрашивание является мерой количества GOT в пробе. 20

Пример 5. Сравнение результатов измерений при применении предлагаемого способа и известного после хранения примененных реактивов.

Для сравнения применяют:

25 реактив по примеру 3; реактив по примеру 3, но бумагу вместо 200 000 ед/л предлагаемой пируватоксидаэы пропитывают 200 000 ед/л известной пируватоксидазы, а также дополнительно 1 ммоль/л пиаминпифосфатом (TPP) 0,5 ммоль/л Мп -ионов

При помощи этих реактивов исследуют 3 пробы с пируватом до и после хранения, которые показывают различ- 35 ную активность GPT. Измерение проводят согласно примеру 3.

Результаты испытаний представлены в табл.4.

Из табл.4 следует, что по предлагаемому способу и после хранения реактива для определения пирувата величина измеряемых значений существенно не отклоняется от базового значения, в то время как согласнб известному способу результаты измерения после о хранения в течение 3 дней при 60 С отклоняются от базовых значений до 607.

Аналогичные результаты получают и в том случае, если вместо реактива для определения пирувата согласно примеру 3 используют реактив согласно примеру 1, который перед хранением лиофилизируют.

Таким образом, предлагаемый способ определения пирувата в биологических объектах обеспечивает досто-, верность результатов. Способ пригоден и для определения субстратов н ферментов, который приводят к образованию пирувата.

Формула и з о б р е т е н и я

Способ определения пируйата в биологических объектах, предусматривающий взаимодействие исследуемой пробы с реактивом, содержащим пируватоксидазу, буфер, пероксидазу, 4-аминоантипиран, и сульфокислоту, последующий анализ его количества путем регистрации образующейся перекиси водорода, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности и достоверности результатов определения за счет предотвращения образования осадков и помутнений, используют пнруватоксидаэу, выделенную нз молочно-кислых бактерий атаииов Lactobacillus plantarum DSM 2571, или Lbc.

salivarius DSM 2573, или Leuconosboc sentегоides DSM 2572, или Streptococcus crernoris DSM 2574, характеризующуюся оптимумом активности при рН 5,7, оптимумом стабильности при рН 5,6-5,8, константой Михазлиса для пирувата при 25 С 0,4 ммодь/л, для фосфата 2,3 ммоль/л, мол.м. 146000 дальтон прн определении в центрифуге по

Специфичность к субстрату,X

Предлага- Известная емая

1 322984 8

Таблица 2

Активность фермента, 7

КонцентраИнгибитор иэвест- предного лагаемого

100 100

0 тора

85

KCN

100

75

100

ЙаИ

100

0,01

ЕДТА

30 100

0,1

85

Таблица 3

Единиц

Стадия

Объем, активпротеина

480

2516 6700 0,37 100

2436 5540 0,44

98

2284 2560 0,89

748 753 1,0

590 102 5,8

30

23,5

Беэ ингибиРастворение — надосадонная яждкость

Фракционирование с сульфатом аммония декстранблау-сефароэа

Фракционирование с сульфатом аммония

АСА 34-мол-сита ция, ммоль/и

Протеин,мг

Удельная ность, ед/мг

Выход, Х

1322984

l0

Та блица 4

Активность GPT, ед/л

Проба

Базовое I без I 3 дня II без 3 дня

0 о значение нагрузки при 60 С нагрузки при 60 С

27,5 29

62 59

209 21!

27

28

59

212

210

Составитель И.Привалова

Техред М.Моргентал Корректор А.Тяско

Редактор Н.Тупица

Заказ 2883/59

Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.,д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r Ужгород, ул.Проектная,4