Штамм вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 1-го серотипа, используемый для специфической лабораторной диагностики

 

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для лабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Целью изобретения является -получение нового штамма .вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 1-го серотипа. fflfaMM Уссури- 4590 В1фуса ГЛПС получают путем последовательного пассирования суспензии легочной ткани восточно-азиатской лесной мьппи, отловленной в природном очаге ГЛПС в Приморском крае, на культур клеток VERO-E6. Штамм храВСЕСОЮЗНАЯ lUrZi rHJ-TEXHIiVim БИБЛИОТЕКА нится в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии нм. Д.И.Ивановского под Ь ГКВ-710 и характеризуется следующими признаками. При электронно-микроскопическом изучении инфицированных клеток VERO-E6 выявляются частицы округлой формы с диаметром окбло 10 нм, окруженные липопротеиновой оболочкой. Вирус размножается в культуре клеток VERO-E6 при 37 С, рН 72-78, множественность заражения составляет не ме.нее 0,1 вирусной частицы на клетку, максимальный титр вируса обнаруживается на 12-14 день после заражения и составляет 40-45 log UDjg /мл. В крови зараженных животных с 10 дня после заражения накапливаются специфические антитела к вирусу ГЛПС, для выявле- . ния которых исследуемые сыворотки крови больных людей наносят на предметные стекла с антигеном вируса Уссури-4590. Основанием для постановки лабораторного диагноза служат результаты метода флуоресцирующих антител, указывающие на четырехкратное или более значительное нарастание титров специфических антител к вирусу ГЛПС во вторых сыворотках. 1 табл. B Cf3 X ел ел ел

р

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ вЂ” РЕСПУБЛИН (19) 01) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (46) 30. 07. 90. Бюл. N- 28 (21) 3944307/28-13 (22) 14. 08. 85 (71) Институт эпидемиологии и микробиологии СО АМН СССР и Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов

АМН СССР (72) P.À.Ñëîíîâà, Т.И.Астахова, М.Е.Косой, E.A.Òêà÷ånêî и Т.K.Äçàãóрова (53) 576.858.25(088.8) (56) Н.W. Lee et al. I. Infect. Мэ.

137:298-308, 1978. (54) ШТАММ ВИРУСА ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ

ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ 1-ГО

СЕРОТИПА, ИСПОЛЬЗУЕМЪЙ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИА! НОСТИКИ (57) Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для лабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Целью изобретения является

-получение нового штамма вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 1-го серотипа. ШТамм Уссури4590 вйруса ГЛПС получают путем последовательного пассирования суспенэии легочной ткани восточно-азиатской лесной мьппи, отловленной в природном очаге ГЛПС в Приморском крае, на культуре клеток Vего-F6. Штамм хра(51) 5 C 12 N 7/00, Л 61 К 39/12

//(С 12 iV 7/00, С 12 R 1;91) нится в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им .

Д.И.Ивановского под Р ГКВ-710 и характеризуется следующими признаками.

При электронно-микроскопическом изучении инфицированных клеток ЧЕГО-Е6 выявляются частицы округлой формы с диаметром около 10 нм, окруженные липопротеиновой оболочкой. Вирус размножается в культуре клеток Vего-Е6 при 37 С, рН 72-78, множественность заражения составляет не менее 0,1 вирусной частицы на клетку, максимальный титр вируса обнаруживается на

12-14 день после заражения и составляет 40-45 1о8 UD /мл. В крови зараженных животных с 10 дня после заражения накапливаются специфические антитела к вирусу ГЛПС, для выявления которьгх исследуемые сыворотки крови больных людей наносят на предметные стекла с антигеном вируса

"Уссури-4590". Основанием для постановки лабораторного диагноза служат результатьг метода флуоресцирующих антител, указывающие на четырехкратное или более значительное нарастание титров специфических антител к вирусу ГЛПС во вторых сыворотках.

1 табл.

19555! 13

И . > о б р е T <. I l I f< < > т н о с l f T < . л к tt It p Q c o.f t < > гии и может быт>. использовано дпя специфической JI; боряторной диагностики геморрягическай лихорадки с почечным cttffctpr>»ntf ffa Дальнем Востоке

СССР.

Целью изобретения является полу:>ение нового шт ffftta вируса геморрягиЧЕСКОЙ ЛИХОРЯДКП С ПОЧЕЧГН>М С1ГНДРОмом (ГЛПС) 1-го серотнпа.

Штамм получают следующим образом.

Используют легочную ткань самца восточно-азиатскои мыши lз возрасте

8-10 месяцев.

Перед исследс>1>алием легкие трижды отмывают в физиологическом растворе (0,853-ном 1>1яС1)> содержащем пенициллш1 (500 eft/м.l), стрепточицин (250 мк г/мл) и кян <>ми>зин (500 ед/мл ).

Затем легкие помещают в стерильную ступку If тщательно растирают в npui сутствии небольшого количества стерильного песк, . 1!об<11зляют и<ой телячьей сыворот> tt ll > тãv ря<-. >етя; чтобы получить 1О :-ну>о с ус пензию легочной тк<н<и (ll;1 t ftl легк><х доб lft— л Лют соот1зе т< . Ttte It!fr> 1, 0 мл <1)II3H0Jfol It ческого раствора) .. !егочную суспен3 I tl<> О Т C R C bt B Bi<1 1 С I < . j > f I Jf f> t t Of П И П Е Т К 0 и переносят El ll!!<. у п<но<зы>1 флакон цептрифугируют tlt>ll 6. 000 об/мин

ТЕЧЕНИЕ 30:litt. Н:ЗдоеядО >НУЮ жпдКОСтЬ осторожнс извлек. > т 11 используют для заражения клет<> ftf<>lf культуры.

Для э я1>яже!t f f tl 1 fr ïîë ьз уют KJleòки

VLtR0 Е6, K ток проводят при 37 С, Через 12 дней с момента инокуляции клеток KóëüòóðàJII I!ófî жидко-.ть сливают, клеточный монослой дважды отмывают раствором Хенкса и обрабатывают последовательно 0,25Х-ftbftf раствором трипсина (2 мл н;1 флакон) и 0,027,.-ным раствором версеня (2 мл ня флакон) по 2 мин кяж>з><м. После удаления версена Флаконы с клетками инкубирукт

1>рtf 37ОC. до поя>злен>lя при tllяков 1зя .>— рыхления моно<.лоя . Затеи 1«! ф:1аконь> добавляют 1 мл свежей питятельн >ft среды с 107. нормальной телячьеи сы5 воротки (НТС) и про>зопят в этом обье1<е < успп f fit tfp0tt 3 f1?Ie If .. 8 э В <. сь инфицированных клеток в обE)effe 0,2 мл смешивают с равным объемои суспензии свежих нормальных клеток <>ЕЕО-Е6, обеспечивая необходимую концентрацию клеточной суспензии (50000 -60000 клеток в 1.мл) добавлением среды Игла-2 HEM с 107 НТС, Через 2 суток инкубирования при 37"С во флаконах 3d

15 м<няют среду poc a Ha среду поддержа ння роста клеток и продолжают инкубиронять клетки при 37 С в течение еще

10 дней. Субкультивироняние инфицированных клеток Uего-Е6 проводят в дальней<нем по аналогичной методике с

12-дневным интер>залом.

Начиная со 2-го пассажа, часть ин<1>ицировянных клеток наносят на пред четные стекла и исследуют методом фокусиру<ощих антител (МА) fl;t присутствие специфического янтигеня вируса

ГЛПС. На уровне 2-ro пассажа специфическоее свечение янтигеня вируса

30 П!ПС обнаруживается линь н единичных клетках. Отмечается цитаплязматическяя локализация антигеня вируса ГЛПС, про> fyttfecvfteftff<> в перинуклеарной зоне инф>гцировянных клеток. По мере

35 я!<я >тяции вируса в пассажаХ наблюдается образование более крупных гранул, которые равномерно заполняют всю цитоплазму клеток. Специфическое свечение определяется кяк ярко-зеленая

40 лю<инесценция на фоне непораженных клеток кирпичного цвета. Количество янтигенположительных клеток заметно возрастает от пассажа к пассажу и составляет 90-100> к 5-6 пассажу. Ци45 топатического эффекта в инфицированньгх культурах не отмечается в течение в<.его периода наблюдения. Ня уровне

6 пассажа суспензии инфицированных клеток разливают по 0 5 мл во флаконы

50 и хранят при минус 60ОС. В дальнейшем эти суспензии используют в качестве посевного вируса и обозначают кяк штамм "Уссури 4590".

55 11!Тамм "Уссури 4590" хранится в

Государственной f oJIJtel;t»ff! вирусов Института вирусологии им. I.И.Ивановского А1Н СССР под 11> ЕБ-710 и характеризуетсн cледу>ашими признаками. (1(9-, 5(I1Рфсээlаг!!«»I .K!I! ПР!Iз«ЛK!!.

При .электронно-микроскоп«!пескам изучен!и! кле foK FRO-Еб, ипфпцирова«ных штаммом "Уссури-4590" вируса

ГЛ1((нь!Являются частицы округ!!аи и !и 5 овал I!nfl формы ". д!!ам»трам в cpegf!eM

100 пм, окруженные хороша контурирующейся липопротеиповой оболочкой.

Иорфология частиц сходна с таковой вирусов семейства Гэуньявириде. 10

Культуральпые признаки.

Оптимальная множественность заражения клеток Vего-Е6 штаммом "Уссури 4590" составээяет не менее О, 1 вирусной частицы на клетку. Оптималь- 15 ной температурой (эазмножепия штамма является 37. С. Бирус стабилен в интервале рН 7,.2-7,8.

Максимальный титр вируса в инфицированных клетках обнаружигается íà 20

12-14 день после заражения и составляет 4,0-4,5 1ор(1В /!!л.

II P tf .!» Рал! .

Для заражения в(!Гусам ГЛПС (штамм

Уссури-4590) используют суспензию клеток его-Е6. После внесения вируссодержащей суспензии во флаконы со нзнесью клеток их гамещают в термастат IlpH 37 С. Культиви(эавание вируса ГЛПС в клетках осуществляют в течение 12-14 сутс к.

На 12 — 14 сутки с начю!а инфицирования клеток ЧЕR0-ЕГ> вирусам ГЛПС ма«аслай клеток последовательна обрабатывают раствором трнпсина и версена, после чего проводят сус!!ендиравание инфицирона «ых клеток в небольшом количестве физиологического раствора. Конечная конце«трация клеток должна составлять 380-400 тысяч в

1 мл.

Лп;и!огич ым образом готовят суспензию норл!альп!!х «»инфицированных кле ТоК ЧЕКО-Е6 . С ус нен зни инфици1эаванных и нармальпьlx кле ток сл!ешивают в равных объемах и раскапывают на предметные стекла «а 3-5 мкл на каждый мазок. После поги!ага высыхания суспепзий препараты фиксируют в охлажденном ацетоне в течение 15-20 мин и затем обрабатывают ультрафиолетовым облучением для ипактивацпи инфекционной активности вируса. Приготовленные таким образом аптигенные прелараты по использования храпят при миffvc 60 С.

Инфекционны» признаки.

При введении штамма "Уссури 4590" вируса ГЛПС лабораторным животным (вэросль!е белые мыши, белые крысы, морские свинки, кролики) клинических проявлений заболевания и их гибели не обнаруживается в течение всего срока наблюдения за животными (да 3-х месяцев с момента инакулиранания ви.руса) . Вместе с тем, начиная с 10 дня после заражения в их крови обнаружи. вается накопление специфических ан — 35 тител к вирусу ГЛПС. Оптимум накопления антител определяется к 25-.30дпю с момента их заражения. Таким образом; экспериментальные животные могут быть использованы для иммуниза- 0 ции и получения иммунных антиГЛПС .сывороток, но не для пассиравания животного .вирус а.

Для выявления специфических антител к вирусу ГЛПС исследуел!ые сыворотки крови больных людей наносят на пРедметные стекла с антигеном вируса

ГЛПС. Сыворотки обследуют в ИФА в разведениях 1: 16 и выше.

Препараты помещают во влажную камеру и выдерживают при 37 С в течение 30 мин и затем стекла 3-кратно промывают 0,01 И фасфатным буферным раствором и сушат при комнатной температуре. На препараты наносят люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека в рабочем разведении, которое определяют и предварительном опыте. Б качестве коптрастера используют раствор Голубого Эванса в канеч— ной концентрации 1: 1!0 000. Препараты вновь ипкубируют ва влаж <ой камере

Полная инактивация инфекционной активности !птамма "Уссури 4590" вируса ГЛПС происходит при ef о нагревании при 60. С в течение 30 мин и при o6— работке ультрафиолетовым облучением . (бактерицидные лампы) в течение 2 ч.

Антигенная активность в первом случае снижается в 4-раза, а во втором случае остается без изменения.

Хра!;ение вирусного н!Тамма осуществляется в виде суспензии инфицированных клеток Vего-E6 с добавлением 5Х

О

НТС при минус 60 С. При таком режиме хранения вирусньп! IIITамм не теряет своей инфекционной и антигенной ак55 4 т!!!!пасти в генеf«f» 1 гада ((-рак набэю,г,»пия) .

1!спальзование штамма "Уссури-4590" для специфиче! кай лабораторной диагпастикll иллюстрируется следующил!

f 319555

Продолжени таблицы

Сыворотка крови День больных ГЛПС болезн итры антител

ИФА с антиеном штамма

Уссури-4590"

1842 (Уфа)

1О

1:16

1:64

1865 (Устинов) 16

1: 16

1:128

97 4 (Владиво20 стОк) 1: 128

1:512!

1022 (Хабаровск)

1: 128

1: 4096

З0 700047 (Корея) 37

1:1024

Титры антител в МФА с антигеном штамма

"Уссури-4590"

День болезни

Сыворотка крови больных ГЛПС

Формула изобретения

1837 (Уфа) 1:16

1:32

58 . 1 64

Составитель M. Серова

Техред Л. Олийнык Корректор М.Демчик

Редактор А.Купрякова

ТиРаж 494,, Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по .делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 2491

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 при 37 С в течение 30 мин, затем их промывают, высушивают и регистрируют с помощью люминесцентного микроскопа.

Для вируса ГЛПС характерна локализация фпуоресцирующего антигена с . четкой гранулярной структурой в цитоплазме клеток. Яркое изумрудно-зеленое грануляпное свечение антигена вируса ГЛПС просматривают на фоне кирпичного,дйрашивания структуры нормальных нейкфицированных клеток,. Такой же кирпично-красный фон отмечают и на ка4ках с нормальной сывороткой, используемой в качестве контроля.

Титром сыворотки считают ее наивысшее разведение, способное еще выявлять специфический антиген вируса ГЛПС.

Для постановки серологического диагноза обследуют две сыворотки крови от каждого больного. Первую сыворотку получают тотчас же после выявления заболевания, а вторую — через 3-5 дней после забора первой. Основанием для постановки лабораторного диагноза служат результаты ИФА, указывающие на четырехкратное или более зна чительное нарастание титров специфических антител к вирусу ГЛПС во вторых сыворотках. Результаты исследова. ний представлены в .таблице, Штамм вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 1-ro cepo. типа ГКВ 11 710 (Государственная коллекция вирусов Института вирусологии им. Д;И.Ивановского AMH CCCP) ис40 польэуемый для специфической лабораторной диагностики.