Консорциум штаммов lеnсоnоsтос oenos вкпм в-3334, pediococcus реnтоsасеns вкпм в-3335,sасснаrомuсеs cerovisiae вкпм y-512,используемый для биологического кислотопонижения вин

 

Изобретение относится к микробиологической , промьгашенности и касается нового консорциума штаммов, который может быть использован для биологического кислотопонижения вин. Консорциум штаммов включает молочнокислые бактерии Leuconoetoc oenos ВКПМ В-3334, Pediococcus pentosaceus ВКПМ В-3335 и дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У-512 при следующем их соотношении соответственно (48- 51) : (42-44) : (5-10). Целью изобретения является получение нового консорциума , обладающего высокой биологической активностью. 6 табл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СО).)ИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ys

,) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3992462/31 — 13 (22) 20.12.85 (46) 23.07.87. Бюл. У 27 (71) Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного (72) Е.И. Квасников, Г.С. Елисеева, И.П. Стогний, С.С. Нагорная, С.P. Резник, Г.И. Козуб, В.Б. Пономарченко, Л.А. Салтыкова и Л.В ° Колегова (53) 663.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 939532, кл. С 12 С 1/02, )980.

Авторское свидетельство СССР

)) 379621, кл. С 12 G I/02, 1971. (54) КОНСОРЦИУМ lllTAMMOB LEUCONOSTOC

0ENOS BKIIM В-3334, PEDIOCOCCUS PENTOSACEUS ВКПМ. В-3335, SACCHAROMYCES (5И 4 С 12 G 1/02, С 12 N I/20, 1/16//

//(С 12 N 1/20, С 12 К 1:01;

С 12 N I/16, С 1,2..R 1:865

СЕКЕЧТБ?АЕ ВКПМ У-51 2, ИСПОЛЬЗУЕМЫ1

ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО КИСЛОТОПОНИЖЕНИЯ

ВИН (57) Изобретение относится к микробиологической.промышленностии касается нового консорциума штаммов, который может быть использован для биологического кислотопонижения вин.

Консорциум штаммов включает молочнокислые бактерии Leuconostoc oenos

ВКПМ В-3334, Pediococcus pentosaceus

BKIIM В-3335 и дрожжи Saccharomyces

cerevisiae ВКПМ У-512 при следующем их соотношении соответственно (485i) : (42-44) : (5-10). Целью изобретения является получение нового кон- ф сорциума, обладающего высокой биологической активностью. 6 табл.

25 завывать аммиак из аргинина.

Сбраживают глюкозу, фруктозу, манноэу, ксилазу. Не сбраживает галактазу, ссрбазу, арабиназу, мальтозу,,сахарозу, целлабиаэу, лактозу, мелибиазу, рафиназу, рамназу, инулин, К—

1 13250

11эобретение относится к микробиологической промьппленнасти и касается нового консорциума штаммов микроорганизмов, который может быть использован для кислатапонижения с целью получения высококачественных марочных вин.

Пелью изобретения является получение нового консорциума штаммов бактерий и дрожжей, обладающего нысокой 10 биологической активностью при регулировании кислотнасти виноматериалов.

В состав консорциума входят штамм молочно-кислых бактерий Leuconostoc

oenos ВКПМ В-3334 (К-48 ф), Pediococ- 15

cus pentosaceus BKILM В-3335 ° (К-48 ф) и дрожжи Saccharomyces cerevisiae.

ВКПБ У-512 (К-48 ф) при их соотношении соответственно (48 — 51) : (4244) : (5-10). 20

Штаммы, входящие в консорциум

К-48 ф, характеризуются следующими морфолого-культуральными и фиэиологобиохимическими признаками °

Штамм Leuconostoc oenos BK11M

В-3334

Mopy лого-культуральные признаки.

Граь оложительный неподвижный факультур льный анаэроб. На агаризованной среде MPC при 28 С на третьи сут- 30 ки дает слабый рост, образуя белые гладкие блестящие колонии диаметром

0,1 — 1 мм. В жидкой среде MPC + вино (1:1) образует мелкодисперсный осадок. Не образуют слизи. 35

У штамма отчетливо наблюдается диморфизм. На жидкой среде MPC с вином (1:1) в ассоциативной культуре с дрожжами образует данные цепочки из кокков овальной формы размером 0,7 х 40 х 1 мкм. При выращивании на агаризованной среде Г1РС обнаруживаются цепочки из какков и диплобациллы из коротких палочек (0,8 х 1,4 мкм). Аналогичное явление описано для штаммов 45

Leuconostoc oenos, ньщеленных из швейцарских вин.

Слабо растет при 10 С, не растет при 45 С. Хороший рост при 15-37 С. физиолого-биохимические признаки. 50

Для штамма характерно образование газа из глюкозы и неспособность обра64 2 метил-D-глюкоэид. салицин, глицерин, дульцит, маннит, сорбит, инозит.

Не усваивает цитрат, не восстанавливает нитраты в нитриты, не разжигает желатин, не гидролизует эскулин, усваивает яблочную и лимонную кислоты.

Каталазаотрицательный, не патогенен.

Штамм Pediococcus pentosaceus ВКПИ

В-3335 °

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительный неподвижный микроаэрафил. На агаризонанной среде MPC о на третьи сутки при 28 С дает хороший рост> образуя белые блестящие гладкие колонии диаметром 1 мм. В жидкой среде MPC + вино (1:1) образуется однородная муть и мелкодисперсный осадок.

Штамм изменяет форму клеток в зависимости от условий культивирования: при росте на жидкой среде совместно с дрожжами и у свежевьщеленного иэ консорциума штамма клетки кокковиднай формы 0,7 х 0,7 мкм располагаются парами. После двух лет культивирования в монокультуре при высене íà MPCагар клетки имеют вид коротких палочек 0,7 Ф 1,0 мкм, обычно в парах, D

Слабо растет при 10 С, обильный рост при 15 и 37 С, при 45 С не растет. физиолого-биохимические признаки.

Штамм ферментирует глюкозу без образования газа.

Сбраживает глюкозу, галактозу, ксилозу, маннозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, салацин. Не сбраживает сорбозу, арабинозу, целлобиоэу, лактоэу, мелибиозу, рафинозу, рамноэу, инулин, Ы-метил-D-глюкоэид, глицерин, дульцит, маннит, сорбит, инозит.

Не восстанавливает нитраты в нитриты, не разжижает желатин, не гидролиэует зскулин, не усваивает цитрат. Усваивает яблочную и лимонную кислоты. Каталазоотрицательный. Не патогенен.

Штамм Saccharomyces cerevisiae

У-512.

Культурально-морфологические признаки.

При росте на сусло-агаре у трехо суточной культуры при 28 С клетки круглые, овальные, одиночные или в парах (размерам 3-5 х 4-10 мкм), Штрих — культура через 3 для на сусла-агаре бледна-кремовая, гладкая, 3 13250 блестящая, края ровные. Аски содержит 1-4 аскоспоры.

Растет на среде без витаминов и при 37 С.

Физиолого-биохимические признаки.

Сбраживает глюкозу, галактозу, мальтозу, сахарозу, рафиноэу на 1/3, лактозу не сбраживает.

Ассимилирует глюкозу, галактоэу, мальтоэу, сахарозу, рафинозу, этанол, 10 молочную и яблочную кислоты. Не ассимилирует 1-сорбозу, целлобиозу, лактозу, инулин, растворимый крахмал, d-ксилозу, I-арабиноэу, d-арабинозу, d-рибоэу, I -рамнозу, глицерин, дуль- 15 цит, маннит, сорбит, К -метил-D-глюкозид, салацин, янтарную и лимонную кислоту, инозит. Не ассимилирует

КГ10

Тип взаимодействий между штаммами д симбиотический. Дрожжи снижают высокий окислительно-восстановительный потенциал среды, который препятствует развитию молочно-кислых бактерий и прохождение яблочно-молочного броже- 25 ния, потребляют молочную кислоту, являющуюся ингибирующим продуктом для молочно-кислых бактерий, способствуют повышению их спирто- и кислотоустойчивости. Бактерии выделяют протеоли- 3р тические ферменты, которые делают среду более доступной для дрожжей.

При выращивании посевного материала на сусло с вином (7:3) соотношение штаммов Leuconostoc oenos, Pediococ- 35

cus pentosaceus u Saccharomyces cerevisiae (48-51) : (42-44) : (50-10) соответственно.

Селекционированный консорциум обладает высокой адаптивной способно- 40 стью и проявляет одинаковую кислотопонижающую активность в винах различного состава.

Снижение консорциумом титруемой кислотности вин различного состава 45 показано в табл.l.

Консорциум интенсивно снижает кислотность вина при глубинном способе культивирования. 50

Кислотопонижению подвергают столовый виноматериал сорта Алиготе с содержанием общего S0a 32 мг/л, свободного SO 3,2 мг/л, спирта 10,2 об.7 сахаров 0,307, с летучей кислотно- 55 стью 0,39 г/л и виноградное сусло не сульфитированное, содержащее 19,07. сахаров °

64 4

Кислотопонижающая активность консорциума дана в табл.2.

Кислотопонижающая активность на вине в 2,8-3,4 раза выше, чем кислатопонижающая активность этой же культуры на сусле. Результаты хроматографического анализа показывают исчезновение не только яблочной кислоты, но и молочной. Содержание летучих кислот остается практически неизменным: в контроле 0,39 г/л, в опыте 0 41 г/л.

Устанавливают степень участия микроорганизмов, составляющих консорциум, в кислотопонижении вина.

Кислотопонижающая активность монокультур молочно-кислых бактерий и дрожжей на виноматериале сорта Алиготе дана в табл.3.

В процессе кислотопонижения вина штаммы, составляющие консорциум, синтезируют витамины группы В, имеющие важное значение для проведения этого процесса. Обогащение вина витаминами путем удвоения их обычного содержания в вине, в частности тиамина, никотиновой кислоты, пиридоксина, биотина и особенно рибофлавина, в отдельности или в сочетаниях, заметно ускоряет сбраживание яблочной кислоты молочно-кислыми бактериями.

Штамм Leuconostoc oenos способен удваивать количество рибофлавина, никотиновой кислоты, тиамина, биотина и пиридоксина в виноматериале при проведении им яблочно-молочного брожения.

Синтез витаминов группы В монокультурами дрожжей и молочно-кислых бактерий приведен в табл.4.

Некоторые штаммы молочно-кислых бактерий могут накапливать в винах нежелательный биогенный амин — гистамин в значительных количествах (до

20 мг/л ), который повинен в серьезных осложнениях при употреблении этих вин. Молочно-кислые бактсрии, входя" щие в состав консорциума, гистамин не образуют.

Консорциум сохраняют на жидкой среде, состоящей из МРС и виномате, о риала (1:1), при С и производят пересевы через каждые 3 мес. При этом культура сохраняет высокую биохимическую активность.

Состав среды Г1РС:

Пептон, г 10

1325064

0,2

Дрожжевой автолиэат,;л 50

Мясная вода, мл 100

Твин-80, мл l

Глюкоза, r 20

Натрий уксуснокислый (СН COONa ЗН P), г 5

Аммоний лимоннокислый трехзамещенный (СН ОN,)Ф г

Фосфорный калий двузамещенный (К НРО ЗН О), г 2

Сернокислый магний (М80„ .7Н,О), r

Сернокислый марганец (МпО 4Н О), г 0 05

Вода дистиллированная До l л

При хранении культур на одной среде МРС кислотопонижающая активность ассоциации снижается, а при разбавлении среды MPC более чем íà 50Х снимается интенсивность роста ассоциации.

Влияние состава среды на интенсивность роста консорциума показано в табл.5. Выращивание посевного материала осуществляют в ферментерах, стерилизованных острым паром, на смеси виноградного сусла и виноматериала (7:3), смесь предварительно пастерио зуют при 70 — 80 С в течение 20 мин.

Засев смеси производят трехсуточной активной культурой, выращенной на разведенном вдвое виноградном сусле иэ расчета 27 к объему смеси.

После максимального накопления биомассы в ферментерах (2100 млн/мл бактериальных клеток и 233 млн/мл дрожжевых) и возникновения процесса кислотопонижения посевной материал вносят в емкости с виноматериалом для проведения биологического кислотопонижения в количестве 37. к объему виноматериала.

Биологическому кислотопонижению подвергают виноматериал с содержанием свободного БО не вьппе 10 мг/л и общего SOä не выше 50 мг/л, концентрацией яблочной кислоты не менее

2 г/л, спирта 10 — 13, рН 2,9 — 3,2 и высокой титруемой кислотностью 1014 г/л при 18-25 С.

Процесс биологического кисло опонижения контролируют путем отбора проб и определения в них тнтруемой кислотности, а также качественного определения наличия винной, яблочной и молочной кислот.

Процесс биологического кислотопоиижения заканчивают при исчезновении пятна яблочной кислоты на хромото1О грамме или после снижения титруемой кислотности до заданных кондиций.

После окончания процесса виноматериал направляют на дальнейшую технологическую обработку согласно принятым

l5 схемам.

Пример. 6 мл жидкой питательной среды, содержащей трехсуточную культуру, засевают 0,5 л колбу, в ко20 торой находится смесь из.210 мл виноградного сусла и 90 мл вина. После достижения максимальной биомассы (2033 млн/мл бактериальных клеток, 226 млн/мл дрожжевых клеток) посевной материал вносят в 9700 мп виноматериала сорта Алиготе, содержащего сахаров 0,20Х, свободного SO

3,2 мг/л, общего SO> 50,8 мг/л, и проводят кислотопонижение при 25 С.

30 После внесения 37 посевного мате" риала в виноматериап концентрация дрожжевых клеток 6,8 млн/мп, бактериальных 61 млн/мл.

В результате кислотопонижения титруемая кислотность снижается до

6,31 г/л, содержание винной кислоты, спирта, летучих кислот остается беэ изменений, яблочная кислота .содержит ся в следовых количествах, окисли40 тельно-восстановительный потенциал снижается в 1,5 раза, рН повьппается до 3,30.

Изменение биохимического состава =

45 вина в результате проведения кислотопонижения виноматериала консорциум

К-48 в дано в табл.6.

Формула изобретения

Консорциум штаммов I.euconostoc

oenos ВКПМ В-3334, Pediococcus pentosaceus BKIIM В-3335, Saccharomyces

cerevisiae ВКПМ У-512, используемый

55 для биологического кислотопонижения вин.

1325064

Т а блица 1

Титруемая композиция, г/л, вин

Образец

Красных

Белых

Каберне

Леанка Ркаци- Фетяска апеави тели

Контроль (до кислотопонизения) 11,0

13,17 10,73 9,57

9,7

Опт (после кислотопоникенмя) 6,3

6,4

6,72

6,42

6,3

Таблицв2

Кислотопони кающая активность консорциума после кислотопэнихения до кислотопопивения

6ТК г/л

Eh, мВ р11 (конечное) Eh мВ

Титруемвя

Титруемвя рН кислот кислот

НОСТЬ> г/л ность г/л

5,74

110

l0,36

3,00

280

l6,I0

13,57

ll,l5

l2,62

12,47

2,9

Столовый виномв» териал

3,30

7,01

6,56

270

3,1

5,4!

3,61

240

5,74

3,3

3,04

200

2,9

l0,92

lO I5

260

1,70

Вииограднов сусло

llO

3,15

2,32

3,1

245 аТН - кислотопонивающая активность (разность менду значениями исходной и конечной титруемой киспотногти) Таблица 3 ислотопоникищал активность ионокультур прн рН виноиатериала рн з,i рн 3 рн 3

1 атк, рн гlл итруеаь, ив титруеиая

Летучка кислотрн атк, г/л ислотность, кислотность, гlл ность, г/л

/л

Контроль(неводное ° èuo) l3,57 э,io

220

0,39

3,30 240

3,50 260

3,40 265

Leucoooatoc оепоа 10,94

2,63 э,эо

275

8,55

2,60

0,94

l,42

l 2, I5

Pediococcua pentoaaceua

3,30

280

9,60

1,55

0,60

Saccharoeycee се- 2,45

raviaiac

l,i2 з,io

3 30 215

22О

o,is

i0 05

i,io

1325064

Та блица 4

Содержание витаминов, мкг/г а.с.в

Штамм

Рибофлавин

Пиридоксин

Биотин

Никотиновая кислота

Тиамин

В клетках

Saccharomyces cerevisiae 3,2

6,2

0,30

2,5

15,7

Pediococcus pentosaceus

15,0

12,5 0,17

20,0

3,2

0,20

Leuconostoc оепов 2,0

15 0

12,5

15,8

В вине, после проведения процесса кислопонижения

Saccharomyces cerevisiae 17,0

60,0 0

Pediococcus pentosaceus

4,50

80,0

300

4,5

Leuconostos oenos l2,0

105,0 4,50

1500

Контроль исходное вино

120 0 4,00

8,0

1500

Результаты даны по содержанию витаминов группы В в вине после проведения процесса кислотопонижения с вычетом контроля содержания витаминов в исходном вине.

Таблица 5

507 MPC + 407 MPC + 20K MPC + IOX MPC +

+ вино + вино + вино + вино

Интенсивность роста консорциума К-48 ф, ед.опт.плотности

0,06

0,07

0,52

0,70

0,72

Т а б л и ц а 6

ЯблочЛетурН

ВинОбразец чие ная ная кискискислоткислоты, г/л

10,86 4ю43 3!50 Оь36 44>5 170 3в10 11 4

6,31 4,42 0,068 0,38 49,5 115 3,30 11,4

Состав среды

До кислотопонижения

После кислотопонижения

Титруемая ность, г/л лота, г/л лота, г/л

Аминный азот, мл/л

Е11, мВ

Спирт, об.7