Способ получения коллагеновых пептидов,содержащих участок связывания с фибронектином

Авторы патента:

C07K14/78 - пептиды, связывающие ткань, например коллаген, эластин, ламинин фибронектин, витропектин, глобулин, нерастворимый на холоде (ГНХ)

Изобрет ние касается пептидов, в частности пс лучения коллагеновых пептидов, со;;ер ая1их участок связывания с фиб1кпи кти 1ом, которые используют в биохимии. Цель - упрощение процесса и повьпиение выходацелевых продуктов. ПолучеЙие ведут бромцианфрагментированием коллагена с последующим хроматографированием в определенных условиях, Хроматографирование ведут на сефарозе с иммоболизированным желатин-связывающим доменом фибронектином, уравновешенном 0,04- 0,06 М трис-НС1-буферным раствором с рН 7,4-7,6, содержащим 0,1-0,15 М. хлористого натрия при скорости тока 150-250 мл/ч и 37-40 С. Затем полонку промывают 1-1,5 М мочевиной в урапновешивафщем буферном раст норе, а элюирование коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином , проводят 4-8 М растворами мочевины в указанном выше буферном растворе. Способ позволяет сократить число стадий с 5 до 2, время процесса в три раза и повысить выход с 5 до 25%. СО ts9 СП

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU 132 511

А1 (5!)4 С 07 К !5/06

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

baal

СЛ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (46) 07.06. 88. Бюл. N - 21 (2!) 3927840/31-04 (22) !2.07.85 (71) Институт биологической и медицинской химии АМН СССР (72) Б.А.Клящицкий, В.Х.Митина, Н.А.Французова, А.E,Áåðìàí, В.В.Бычкова и В.И.Мазуров (53) 547.964.4.07(088.8) (56) М.Click, P.Bornstein "Isolation

and characterization of the cyanogen

bromide peptides from 11 and 3 2 chains of human skin collagen". Piochemistry !970, 9, 24, 4699-4706. (54) Сl!ОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНОВЫХ

ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖА!!!ИХ УЧАСТОК СВЯЗЫВАНИЯ С ФИБРОНЕКТН!!ОМ (57) Изобретение касается пептидов, в частности получе»»ня коллагеновых пептидов, содержал»их участок связывания с ф»»бро»»..ктн.»ом, которые используют в биоми»»»»;», Цель вЂ” упрощение процесса и повышение выхода- целевых продуктов. Получейие ведут бромцианфрагментированием коллагена с последующим хроматографированием в определенных условиях. Хроматографирование ведут на сефарозе с иммоболизированным желатин-связывающим доменом фибронектином, уравновешенном 0,040,06 М трис-НС1-буферным раствором с рН 7,4-7,6, содержащим 0,1-0,15 М, хлористого натрия при скорости тока

150-25О мл/ч и 37-40 С. Затем полонку промывают 1-1,5 М мочевиной в уравновешива»0шем буферном растворе, I а элюирование коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектнном, проводят 4-8 М раствора- Е ми мочевины в указанном выше буферном растворе. Способ позволяет сократить число стадий с 5 до 2, время процесса в три раза и повь»сить выход с 5 до 257..! 13275

Изобретение относится к усовершен ствованному способу получения коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, биологически активных соединений, которые находят применение в биохимии.

Цель изобретения - упрощение процесса коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронекти" !О ном, повышение выхода целевого продукта.

Пример 1. Получение d l-СВ 7 бромцианоного пептида коллагена.

А. Бромциан вЂ” фрагментация целой молекулы коллагена. Раствор 180 мг коллагена из кожи крыс в 18 мл

70 -ной муравьиной кислоты насыщают

И.„, добавляют 200 мг бромистого циана и полученную смесь инкубируют 5 ч при 25 С. Реакционную смесь обессоо

20 ливают на колонке с биогелем P-2 (Ч 100 мл), уравновешенным 0,1 М уксусной кислотой, Скорость тока

45 мл/ч. Фракцию, ныходящую с исключающим объемом колонки,.лиофилиэуют и получают 165 мг смеси бромцианоных пептидов коллагена, Б. Выделение d 1-СВ7 пептида из смеси бромцианоных пептидов коллагена. Полученную смесь бромцианоных

ЗО пептидов коллагена (!65 мг) растворяют в 20 мл 0,05 М трис-НС1 рН 7,4., с 0,15 M хлористым натрием при нагревании до 40 С и раствор перемешивают при 20 С в течение 1 ч с 15 мл сефарозы 4В, содержащей иммобилизонаниый желатинснязынающий домен фибронектина (мол.в. 45000) (содержание домена в адсорбенте 1-2 мг/мл упакованного объейа геля). Затем адсорбент упаковывают в колонку, промывают уравновешивающим буферным раствором (50 мл), затем тем же раствором, содержащим 1 M моченину (50 мл). Скорость тока 200 мл/ч. d 1-СВ7 пептид 45 элюируют уравновешивающим буферным раствором, содержащим 4 М моченину.

Фракцию, содержащую 1-СВ7 пептид, обессолинают на колонке с биогелем

Р-2, уравновешенным 0,1 М уксусной 50 кислотой, и лиофилизуют. Выход d !-СВ7 пептида 7,5 мг -.(25X). Продукт был электрофоретически гомогенным при электрофорезе в полиакриламидном ге" ле в присутствии додецилсульфата нат- 55 рия (мол. в. около 25000).

При скорости потока 150 мл/ч, температуре 37 С получают d l"ÑÂ7 пептид с вьгходом 27 ., ll 2

11 р и м е р 2. Получение насцентных коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибропектином.

Раствор смеси насцентных Р„-пепти" дов, полученных в бесклеточной системе биосинтеза белка и меченных Нпролином (суммарная радиоактивность

1,5 ° 10 распадов/мин), в 3 мл 0,05 М трис-НС1, рН 7,6, с 0,15 М хлористым натрием инкубируют в течение 1 ч при

20 С с 3 мл иммобилиэоваиного на сефарозе 4В желатинсвяэывающего доме- . на фибронектина. Адсорбент упаковыва" ют н колонку, промывают 40 мл уравновешивающего буферного раствора до от" сутствия радиоактивности в элюатах.

Скорость тока 200 мл/ч. Затем колонку.промывают 1 М мочевиной в уравновешивающем буферном растворе (15 мл) и насцентные пептиды коллагена, содержащие участок связывания с фибро" нектином, элюнруют 8 И мочевиной в уравновешивающем буферном растворе.

Суммарная радиоактивность полученной фракции (6 мл) - 5 10 распадов/мин.

После диализа этой. фракции против

0,05 M трис-НС1 буферного раствора, рН 7,6, содержащего 1 М хлористый натрий, проводят анализ целевых насцентных пептидов коллагеназной реакцией.

Аналогичные результаты получены при проведении хроматографии смеси насцентных пептидов при 40 С и скорасти тока 250 мл/ч.

К 0 1 мл исходных и полученных после хроматографии насцентных Р вЂ” . пептидов, меченных !Н-пролином (l !О распадон/мин), добавляют 10 мкл

3 раствора коллагеназы (1-5 мкг белка), свободной от примеси других протеинаэ. Контрольные пробы не содержат коллагеназу. 11робы инкубируют н течение 90 мин при 37 С, после чего пептиды осаждают равным объемом ,l0X-ной трихлоруксусной кислоты с

0,5Х таннина. Осадки собирают на фильтры (Millipor), высушивают и определяют радиоактивность в сцинтилляционном счетчике. Расщепление Рпептидов рассчитывают по формуле

0п 100

Р =!00 --- вЂ”вЂ” е

К где 0„ - радиоактивность опытных проб;

К вЂ” радиоактивность контрольных проб.

27511 4

1О

3 l3

Согласно полученным данным исходная смесь насцентпых P -пептидов расщеплялась коллагенаэой на !57, в то время как насцентные пептиды, элюированиые с аффинного адсорбента 8 M. мочевиной в уранновешивающем буферном растворе, расщеплялись Hà 90Х.

Таким образом, элюированный с колонки препарат на 90Х состоит из насцентных коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, Пример 3. А, Получение желатинсвяэывающего домена фибронектина.

300 мг лиофилиэованного фибронектина иэ плазмы крови человека суспендируют в 60 мл 0,025 М трис-НСI буферного раствора, содержащего 0,5 ммоль

ЭДТА и 50 ммоль NaC1 (рН 7,0), добавляют I мг Ы-химотрипсина и смесь инкубируют при перемешивании 1 ч при

37 C. Затем к смеси добавляют 3 мг ингибитора трипсина из соевых бобов и ммоль фенилметилсульфонилфторида, через )О мин центрифугируют при

10000 об/мин н течение 10 мин, супернатант наносят на колонку (V 60 мп) с желатин (сефарозой) уравновешенную

0,025 М трис-НСI буферным раствором с 0,5 ммоль ЭДТА и 50 ммоль NaC1 (рН 7,0), колонку промывают тем же буферным раствором до отсутствия поглощения при 280 нм н элюатах и желатинсвязывающий домен фибронектина элюиронали, добавляя в буферный раствор 4 М мочевину. Соответствующие фракции (60 мл) диализуют против

2 л 0,1 M уксусной кислоты. Выход желатинснязывающего домена после лиофилизации вЂ” 25 мг, мол. масса около 45000. При электрофорезе в

l2,5i.-полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфоната натрия продукт был гомогенен.

Б. Получение адсорбента "домен фибронектина (мол. масса 45000) сефароза 4В".

Лиофипизованиый желатинсвязывающий домен фибронектина, полученный в и. А (25 мг),растворяют в 15 мл

0,l М бикарбонатного буферного раствора, рН 8,4, содержащего 0,15 М

NaC1 и перемешивают с 15 мл BrCNâ€” активиронанной сефарозы 4В (активирована по стандартной методике с использованием 2 r BrCN íà 10 мл упакованного объема сефарозы) в течео иие 16 ч при 4 С. Сорбент промынают

50 мл того же буферного раствора, 50 мл воды и перемешивают 2 ч прн

20Я(: с 15 мл М раствора этаноламина (рН 9 с помощью 6 н, НС1), Сдрбент отделяют и триждь промывают по 50 мл

0,1 М натрийацетатного буферного раствора с М NaC1 рН 4,5 и .О,l М натрийборатного буферного раствора с

1 М ИаС1, рН 9. После промывания водой сорбент хранят в виде суспензии в воде в присутствии 0,02Х азида натрия. Количество присоединенного домена определяют дифференциальным методом по разности поглощения при

280 им исходного раствора лиганда и промывных вод после присоединения.

Сорбент содержал 1,5 мг домена на

1 мл упакованного объема геля.

Такие параметры хроматографического процесса, как геометрия колон ки или условия последующего обессоливания соответствующих фракций не сказываются на конечных результатах.

Обессолинание фракций проводят на колонках с биогелем Р-2, уравновешенных 0,1 М уксусной кислотой, при скорости тока 30-50 мл/ч и объемном соотношении вводимого образца к общему объему колонки !:5. Те же результаты

30 получены и при использовании для обессолинания сефадекса С-25. Что касается скорости тока при афинной .хроматографии, то хроматографию денатуриронанного коллагена и коллагеноных

35 пептидов обычно проводят при температуре до 40 С и при большой скорости тока из-за склонности этих биополимерон к ренатурации и гелеобразованию.

Поэтому скорость тока в описываемом процессе целесообразно поддерживать в интервале 150-250 мл/ч. Выбор уравновешивающего буферного раствора (0,05 М трис-HCI, рН 7, 4-7,6 с О,I0,15 НаС1) обусловлен необходимостью создания на колонке оптимальных условий для взаимодействия иммобилизонанного домена с пептидами, содержащими участок связывания с фибронектином.

При использовании 0,04-0,06 М буферов результаты выделения оказываются практически идентичными, как и в случае использования 0,1-0,15 М концентраций NaC1. Применение концентраций

NaC1 менее 0,1 М приводит к менее чистым пептидам, содержащим участок связывания с фибронектином, а более

0,15 М - к элюиронанию части этих пептидов при промывании колонки уравновешивающим буферным раствором и

Составитель В.Волкова

Редактор -Т.Герасимова Техред И.Верес Корректор А,Тяско

Тираж 348 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета. СССР ло делам изобретений и открытий

1!3035, Москва, )K-35, Раушская наб,, д, 4/5

Заказ 3392

Производственно-полиграфическое предприятие, г. ужгород, ул. !!р»-.к.глав,4

5 13275 ! И мочевиной в том же буфере, что уменьшает выход целевого продукта.

Стадия промывания колонки 1 М мочевиной предназначена для удаления с колонки неспицифически адсорбиро5 ванных пептидон, не содержащих участка связывания с фибронектином, Для этой цели использованы растворы мочевины в концентрации.1-1,5 М. При . концентрации моченины меньше 1 M неспецифические пептиды удаляются не полностью, загрязняя целевбй продукт, при концентрации,большей, чем 1,5 И происходит частичное элюирование коллагеиовых пептидоЬ, содержащих участок связывания с фибронектином, что снижает выход целевых продуктов.

То же относится и к условиям элюции, поскольку согласно биохимическим данным 4-8 N мочевина эффективно разобщает биоспецифическое взаимодействие фибронектина и коллагена (желатина)

При использовании концентрации мочевины меньшей, чем н описываемом про" цессе, возможно вымывание пептидов неспецифически связанных с сорбентом за счет электростатических или гидрое фобных взаимодействий.

Пример 4. Раствор бромцианоных пептидов Ы 1-цепи коллагена (100мг1 в 12 мл 0,06 М трис-НСI, рН 7,5 с

0 1 М хлористым натрием перемешивают при 20 0 в течение 1 ч с 10 мл сефарозы CL-4B, содержащей иммобилизован. йый желатин-связывающий домен фибронектина (1 мг/мл упакованного объе" ма), сорбент упаковывают н колонку, промывают уравновешивающим буферным раствором (50 мл), затем тем же раствором, содержащим 1,5 M мочевину (30 мл). Скорость тока 150 мл/ч.Целе40 вой Й 1-СВ7. пептид элюируют уравнове11 6 шивающим буферным раствором, содержащим 6М моченину. Соответстнункцую фракцию обессоливают на колонке с биогелем Р-2 уравновешенным 0,1 М уксус" ной кислотой, лиофилизируют. Выход а!"СВ7 пептида 4,4 мг (24,5X)i Ilpoдукт идентичен Ы 1-СВ7 пелтиду, полученному в примере 1.

Описываемый способ получения нас- . центных пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, позволяет сократить число стадий с 5 до

2 время проведения процесса сокра- щается в три раза, ныход увеличивается в пять раз (с 5Х до 25X).

Формула изобретения

Способ. получения коллагеноных пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, включающий броманфрагментирование коллагенна и последующую хроматографию смеси бромциановых пептидов с. использованием в качестве элюента буферных растворов, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода, хроматографию проводят на сефарозе с иммобилизованным желатинсвязывающим доменом фибронектина, уравновешенном 0,04-0,06 М трис-НС! буферным раствором с рН 7,4-7,6, содержащим 0,10-0,15 М хлористого натрия при скорости тока 150-250 мл/ч, температуре 37-40 C с последующим промыванием колонки 1-1,5 М мочевиной в уравновешивающем буферном растворе, элюиронание коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, проводят 4-8 М растворами мочевины н том же буферном растворе.

Способ получения коллагеновых пептидов,содержащих участок связывания с фибронектином

Белковая смесь для связывания стероидных гормонов в биологических жидкостях и способ ее получения // 758742

Способ получения калликреинтрипсин-ингибитора // 503511

Визуализирующий агент и способ обнаружения материала, содержащего фибрин // 2109750

Изобретение относится к диагностике и лечению таких заболеваний, как атеросклероз и тромбоз

Новые синтетические пептиды, легочная поверхностно-активная композиция, лекарственный препарат для лечения респираторного дистресс-синдрома // 2144925

Полипептиды, обладающие активностью легочно-поверхностно активного вещества, и фармкомпозиция // 2145611

Изобретение относится к легочным поверхностно-активным полипептидам, способу их получения и к содержащим их композициям

Богатые гидроксипролином белки и содержащие их косметические препаративные формы // 2163266

Изобретение относится к богатым гидроксипролином гликопротеинам, которые имеют среднюю молекулярную массу 20000 Дальтон и высокую растворимость в воде

Культивируемые эндотелиальные клетки, экспрессирующие белок, обладающий ib-активностью, последовательность днк, кодирующая белок, рекомбинантная конструкция днк, способ получения клеток, белок, обладающий ib-активностью // 2164415

Изобретение относится к медицине

Способ стерилизации нативного коллагена в жидкой среде, полученный стерильный нативный коллаген, содержащие его композиции и их применение // 2188206

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения коллагена из солюбилизированного и очищенного, возможно, пепсинизированного экстракта нестерильного нативного или ателопептидного коллагена, включающему: i) стадию перемешивания и сдвига указанного экстракта в смесителе с двойными поперечными резцами при поэтапном повышении первоначальной скорости перемешивания на 500-1000 об/мин без превышения скорости 10000 об/мин и при поэтапном повышении температуры на 2-10oС, предпочтительно на 3-5oС, таким образом, чтобы увеличить исходную окружающую температуру экстракта до максимально контролируемой температуры, составляющей не выше 50oС, а затем ii) стадию стерилизации в жидкой среде указанного экстракта с получением стерильного коллагена в нативной или ателопептидной форме, к нативному или ателопептидному коллагену типа I, полученному в условиях вышеуказанного способа, имеющему следующие характеристики или свойства: соотношение 2(I)1/1(I)2 от 0,48 до 0,52; стерильность в соответствии со стандартом Европейской Фармакопеи; общее содержание азота от 17,0 до 18,7%; гидроксипролин от 12 до 13,9%; не содержит триптофан, аминогликаны и полипептиды с мол.м

Меченые аналоги глутамина и лизина // 2205186

Изобретение относится к соединениям формулы Y-(CR2)n-X-NHJ, где Х представляет собой С=O или CR2; n является целым числом, имеющим значение от 1 до 6; Y представляет собой L(A)m- или R1R2CR-, где L - металлокомплексообразующий агент, А представляет собой -CR2-, -NRCO-, -CONR- или полиалкиленгликоль; m является целым числом, имеющим значение от 0 до 10; где один из R1 и R2 является -NH(B)p Z1 и другой является -CO(B)qZ2, где р и q являются целыми числами, имеющими значение от 0 до 20, и каждый В независимо выбирают из Q или остатка аминокислоты, где Q является циклическим пептидом; Z1 и Z2 - защитные группы, которые являются биосовместимыми группами, которые ингибируют или подавляют метаболизм пептида in vivo; J и каждую R-группу независимо выбирают из Н, C1-4 алкила или С1-4 алкоксиалкила; при условии, что (i) общее число остатков аминокислот в R1 и R2 группах не превышает 20; (ii) если Х является CR2, то Y является -CRR1R2, и Z2 является металлокомплексообразующим агентом; (ii) если Y является -CRR1R2, то по крайней мере один из R1 и R2 несет, по крайней мере, одну детектируемую частицу

Низкомолекулярные производные пептидов как ингибиторы взаимодействия ламинина/нидогена // 2262509

Рецептор edb-домена фибронектина // 2280254

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине

Низкомолекулярные производные пептидов как ингибиторы взаимодействия ламинина/нидогена // 2380371