Способ определения инсектицидной активности bacillus тнuringiеnsis

 

Изобретение относится к области.микробиологических средств защиты растений и позволяет ускорить процесс определения инсектицидной активности Bacillus thuringiensis . Личинки большой вощинной моли заражают культурой Bacillus thuringiensis ч инкубируют гусениц, выделяют из них и гомогенизируют кишечники. Из гомогената удаляют твердую фазу. В жидкой фазе определяют эстеразную активность, по калибровочной кривой соответствия ЛКзо начальной скорости эстеразной реакции оценивают инсектицидную активность. Калибровочную кривую строят по результатам измерений трех штаммов с известными ЛКбо. 2 ил., 2 табл. SS (Л со ьо оо Oi о:

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 AOI N 63 00

ФСЕЮЖо г46

1 OllHCAHHE ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

C н ."

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3941195/28-13 (22) 12.08.86 (46) 0 7.08.87. Бюл. № 29 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) А. Н. Наумов и В. В. Кувичкин (53) 576.8 (088.8) (56) Энтобактерин сухой. ГОСТ 21108 — 75.

2. Faust R. М. Dougherty Е. М., Heimре1 А. М., Reichelderfer С. F. Standartisation

of the Endotoxin Produced by Several Varieties of Bacillus thuringiensis. — Journal

of Economic. Entomology, 1971, v. 64, 3. р. 610 †6

„.ЯО„„1327866 А 1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ BACI LLL! S

THU RING I ENS IS (57) Изобретение относится к области,микробиологических средств защиты растений и позволяет ускорить процесс определения инсектицидной активности Bacillus thuringiensis. Личинки большой вощинной моли заражают культурой Bacillus thuringiensis 3 — 5 ч инкубируют гусениц, выделяют из них и гомогенизируют кишечники. Из гомогената удаляют твердую фазу. В жидкой фазе определяют эстеразную активность, по калибровочной кривой соответствия ЛК50 начальной скорости эстеразной реакции оценивают инсектицидную активность. Калибровочную кривую строят по результатам измерений трех штаммов с известными ЛК50. 2 ил., ф

2 табл.

1327866

Изобретение относится к области микробиологических средств защиты растений и может быть использовано для контроля активности Bacillus thuringiensis.

Цель изобретения — — ускорение процесса определения инсектицидной активности

Bacil lus thuringiensis.

На фиг. 1 изображен калибровочный график для определения активности; на фиг. 2 — кривая реакции взаимодействия субстрата и фермента. 10

Определение проводят на личинках большой вощинной моли, зараженных культурой

Bacillus thuringiensis. После инкубации выделяют кишечники, гомогенизируют, фильт руют и измеряют активность кишечных эстераз. По результатам измерений трех штаммов с известными ЛК;р строят калибровочный график зависимости скорости реакции взаимодействия эстераз кишечника и

Bacillus йш ingi< nsis от инсектицидной акTkkBkkocTH. Для этой цели по оси абсцисс 20 (фиг. 1) откладывают величины ЛКьо, а по оси ординат начальную скорость реак ции V, Начальную скорость реакции измеряют на флуориметре. Самописец флуориметра вычерчивает кривую реакции взаимодействия субстрата и фермента (фиг. 2). По оси абсцисс время реакции t, а по оси ординат интенсивность флуоресценции. Если лз начальной точки О провести касательную к линии, полученной на самописце, и определить тангенс угла наклона этой касательной к оси абсцисс, то получают численное выражение начальной скорости реакции.

Измеренную скорость отмечают на калибровочном графике на оси ординат (точка

Х, фиг. 1). Из этой точки проводят .линию, параллельную оси абсцисс до пересечения

35 с калибровочной линией. Из точки пересечения опускают на ось абсцисс перпендикуляр, основание которого и указывает на искомую величину ЛКм.

Пример Пяти личинкам 7 возраста 40 большой вощинной моли вводят по 2- — 3 мкл шприцем pегоs суспензию Bacillus thuringiensjs

Зараженных личинок помещают в чашки

Петри без корма и ставят в термостат при 33 С на 3 — 5 ч. После инкубации выделяют кишечники 5 личинок, гомогенизируют их вместе в 30 мл 0,1М фосфатного буфера рН 7,5,фильтруют. В кювету налива.ют фильтрат, добавляют флуоресцеиндиацетат, растворенный в ацетоне (2,5 мг/мл) и измеряют на флуориметре начальную скорость реакции при 520 нм. В табл. 1 показаны результаты биоиспытания и определение активности с использованием кишечных эстераз (коэффициент корреляции — 0,96).

Коэффициент корреляции считают по формуле

Х x — х

Z.(x — x) y (y — у) где X — ЛКм в биоиспытании;

Y — начальная скорость;

Х и Y — - средние арифметические величины;

r — коэффициент корреляции.

Расчет коэффициента корреляции приведен в табл. 2 (г=0,96).

Измерение эстеразной активности кишечного гомогената личинок насекомых выбрано потому, что эстеразы — наиболее реактивная группа ферментов, дающая значительное отклонение активности от нормы при введении насекомым токсинов, продуцируемых Bacillus thuringiensis. Причем изменение активности можно наблюдать уже в первые часы после введения токсина, что особенно важно для создания экспрессметода. Предлагается измерять эстеразную активность в гомогенате кишечника потому, что в кишечнике сосредоточено 95,8ОО всей эстеразной активности. Кроме того, берется вид насекомых, который восприимчив к испытуемому препарату (в данном случае личинки пчелиной огневки).

Предлагаемый способ позволяет сократить время испытания до 5 ч по сравнению с тремя сутками в биоиспытаниях; определять активность культуры без выделения и очистки эндотоксина, а также достичь высокой степени корреляции с биоиспытанием на насекомых (0,96).

Формула изобретения

Способ определения инсектицидной активности Bacillus thuringiensis, включающий заражение гусениц, инкубирование их и оценку инсектицидной активности, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени определения, инкубирование гусениц осуществляют 3 — 5 ч, затем из них выделяют кишечники, гомогенизируют их, из гомогената удаляют твердую фазу, в жидкой фазе определяют эстеразную активность, а оценку инсектицидной активности осуществляют по калибровочной кривой соответствия ЛК О начальной скорости эстеразной реакции.

1327866

Таблица 1

ЛК5о, определенная по эстераэной акНачальная скорость

ЛК о, определен— ная на тест-на—

Штамм тивности секомых

0,65

119

0,76

69-6

1227

0,77

0,91

1070

Таблица 2

ЛК о, Начальная скорость, Х Y

2,82

О, 0144

О, 0001

-23,5 -О, 12

552, 2

6,9

0,65

О, 114 129,9

-11,4 -О, 01

29, 16

-5,4

5,684 1648,3 0,0196

Я 8,62 é 2359,5 .0,034 1

40,6 О, 14

X=30,4 Y=0,77

В гу

Фиг. 1

Puz. Р

Составитель О. Борисова

Редактор Е. Папп Техред И. Верес Корректор М. Демчик

Заказ 3415/3 Тираж б29 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

6, 9 ° 10в

1,9 ° 10

2,5 ° 10

7, 1 .107

19 0,76

25 0,77

71 0,91

7,6.10

2,04-10

2, 14. 10

7,9 10 — 2 — г

Х-Х - (Х-X) (Ъ-К) (Х-Х) (- )