Способ определения физиологического состояния бактериальных клеток еsснеriснiа coli в препарате

 

Изобретение относится к области практической и экспериментальной микробиологии. Целью изобретения является упрощение способа и сокращение времени определения. Способ заключается в том, что дифференцируют бактериальные клетки в высушенном препарате Escherichia coli по их светооптическим характеристикам и по содержанию оптически плотных и структурированных клеток судят о жизнеспособности , а по содержаниюоптически плотных клеток - об устойчивости к стрессовым воздействиям. 1 табл., 2 ил. W СА N5 00 СдР vj

СООЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 С )2 1/02

ВСЕГО " "" ,ц„ 13

И611",:г:

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н Д ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3939984/28-13 (22) 02.08,85 (46) 07.08,87.Бюл. М - 29 (7)) Всесоюзный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов (72) Е,Н.Свентицкий, А.Г.Сергеев, Г.А.Савкова и О.В.Андреева (53) 663.18 (088.8) (56) Марченкова Т,В., Гуревич 10,А, Жизнеспособность культуры кишечной палочки. - Микробиология, 1976,т,45, У6, с.1100-1101.

„„SU„,, 1328377 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК

ESCHERICHIA COLI В ПРЕПАРАТЕ (57) Изобретение относится к области практической и экспериментальной микробиологии. Целью изобретения является упрощение способа и сокращение времени определения. Способ заключается в том, что дифференцируют бактериальные клетки в высушенном препарате Escherichia coli по их светооптическим характеристикам и по содержанию оптически плотных и структурированных клеток судят о жизнеспособности, а по содержайию оптически плотных клеток — об устойчивости к стрессовым воздействиям. 1 табл., 2 ил.

1 132837

Изобретение относится к практической и экспериментальной микробиологии, в частности к способу определения жизнеспособности и устойчивости биопрепаратов к стрессовым воздейст5 виям, Цель изобретения — упрощение способа и сокращение времени определения, 10

Способ осуществляется путем микроскопирования в фазовом контрасте высушенных бактериальных клеток Е.со1х в препарате. Для этого на чистое покровное стекло наносят 2-5 мкл 0 01

0,05 -ного раствора тетрабората натрия, который, являясь эмульгатором, препятствует агрегированию клеток, Затем сюда же вносят 1-10 нл исследуемого биопрепарата и, тщательно перемешав, дают суспензии высохнуть °

Количество материала выбирают таким образом, чтобы пятно слегка опалесцировало, а на просвет было прозрачным, Полученный таким образом препа- 2б рат укрепляют на предметном стекле с помощью смазки, следя за тем, чтобы пятно оставалось. сухим, и микроскопируют указанным способом.

В поле зрения микроскопа можно наблюдать три типа клеток, которые характеризуются строго определенными морфологическими и связанными с ними светооптическими характеристиками, Пользуются оптическими признаками, подразумевая взаимно однозначное соответствие морфологическим

<ф признакам клетки, Тип L. Оптически пустые клетки округлой формы. Хорошо видна оболоч- 40 ка, но структурные элементы внутри микроорганизма отсутствуют, Тип G, Клетки с оптической структурой вытянутой (овальной) формы.

Внутри хорошо различимой оболочки 4S имеют место структурные элементы, например, полюса.

Тип S. Оптически плотные (темные) клетки вытянутой формы, Структурные элементы едва различимы. 50

С помощью окулярной сетки определяют абсолютное, а затем и относительное содержание в препарате клеток с рассмотренными признаками.

Ведение анализа сухих бактериальных препаратов позволяет сократить время определения жизнеспособности до 3-5 мин с погрешностью, не превышающей 2Х, с одновременным определе7 2 нием устойчивости микробной популяции к стрессовым воздействиям.

Использование предлагаемого способа позволяет дополнительно определить устойчивость микробной популя-. ции к стрессовым воздействиям и существенно (до 3-5 мин, или в 400—

500 раз) уменьшить время анализа биопрепарата.

Пример 1. На покровное стекло наносят 2 мкл 0,05 .-ного раствора тетрабората натрия и сюда же-вносят

2 нл исследуемой культуры Е.coli c жизнеспособностью по данным биологического контроля 57 . Препарату дают высохнуть, укрепляют на предметном стекле и микроскопируют в фазовом контрасте с объективом 70х и окуля° ром 10х. В препарате определяют относительное содержание клеток с определенными оптическими характеристиками: L-тип 43X, G-тип 40, Sтип 8 ° Жизнеспособность исследуемого биопрепарата: G + $ = 57X опреде» ляется суммарным содержанием клеток

G- u S-типа.

Пример 2. Препарат готовят .и микроскопируют аналогично примеру

1, По данным биоконтроля высушенный образец характеризуется жизнеспособностью 14Х. В поле зрения микроскопа определяют относительное содержание клеток с определенными оптическими характеристиками: L-тип 34X G-тип

52, S-тип 14 . Устойчивость препара та к высушиванию 14 определяется со- держанием клеток S-типа.

Пример 3. Препарат лиофилизированной культуры готовят и микроскопируют аналогично примеру 1 ° По данным биологического контроля бактериальный препарат характеризуется жизнеспособностью 7Х. Затраты времени, необходимого для проведения ана" лиза, около 28 ч. В поле зрения мик« раскопа определяют относительное содержание клеток с определенными оптическими признаками: L-тип 53Х, G- òèï 40 ., 8-тип 7Х. Устойчивость препарата к высушиванию 7Х определяется содержанием клеток S-типа. Затраты времени 5-б мин, В табл.1 представлены результаты определения жизнеспособности и устой чивости к высушиванию различных бактериальных препаратов Е.coli. Микрокультуральный метод показал, что относительное содержание клеток, обра77 4 работ приблизительно в 300 раз (272 раза) . Необходимо отметить, что предлагаемый способ позволяет исследовать на одном покровном стекле до

9-16 препаратов, следовательно,суммарная эффективность может быть повышена еще примерно вдвое, т.е ° доведена до уровня 400-500 раэ.

Зависимость результатов микрокультурального метода определения жизнеспособности биопрепарата от содержания клеток G- u S-.òèïîâ представлена на фиг.1. Аналогичная зависимость для высушенных образцов и содержания клеток S-типа представлена на фиг.2.

Содержание в препарате клеток G- u

S-типов определяет жизнеспособность микробной популяции, а содержание клеток S-типа — ее устойчивость к стрессовому воздействию. В таблице представлены результаты исследования различных биопрепаратов, 1 з 13283 зовавших колонии до высушивания препарата, составляет соответственно

70 и 22Х для штамма E.coli M-17 и

90 и 95Х для штамма К-12, Определение относительного содер5 жания клеток G- u S-типов показывает, что суммарное их количество 71, 22Х дпя E,coli М-17 и 91, 94Х для

E,coli К-12 соответствует значениям жизнеспособности, определенным микрокультуральным методом. С другой стороны, высушенные различными способа-. ми бактериальные препараты характеризуются пониженной жизнеспособностью, которая по данным биологического контроля составляет 5 и 19Х для E ° coli М-17 и OX для штамма К-12. Иорфологический анализ позволяет определить, что содержание клеток S-типа составляет соответственно 4,19 и ОХ, следовательно, присутствие клеток

S-типа характеризует жизнеспособность микробной популяции после стресса, т.е. ее устойчивость к высушиванию. 2б

Приводим результаты хронометрирования предлагаемого способа по сравнению с известным. Известный микрокультуральный метод при условии наличия необходимых веществ химической чистоты предусматривает следующие операции: приготовление питательной среды и нанесение ее тонкой пленкой на предметное стекло 2,5 ч, нанесение на питательную подложку

35 исследуемой культуры, подсушивание и герметизация покровным стеклом

0,5ч, 1-е микроскопирование препарата 0,1ч, инкубирование в течение

16-24 ч при 21 С, 2-е микроскопирование с определением числа микроколоний 0,1ч, Согласно предлагаемому способу проводят следующие операции: приготовление раствора тетраборатанатрия 1мин; при-. 4 готовление препарата 2 мин;микроскопи рование 3-8 мин. Общие затраты времени составляют 6 мин. Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает повышение эффективности микробиологических

Применение предлагаемого способа определения физиологического состояния бактериальных клеток позволяет по .сравнению существенно упростить анализ биопрепарата и уменьшить (в

400-500 раз) время определения жизнеспособности и устойчивости микробных клеток к стрессовым воздействиям.

Формула изобретения

Способ определения физиологического состояния бактериальных клеток

Escherichia coli в препарате путем микроскопирования, о т л и ч а ю— шийся, тем, что, с целью упрощения способа и сокращения времени оп" ределения, в процессе микроскопиро" вания осуществляют дифференциацию микроорганизмов в препарате,по их светооптическим характеристикам и по содержанию оптически плотных и структурированных клеток оценивают их жизнеспособность, а по содержанию оптически плотных клеток - устойчивость к стрессовым воздействиям, 1328377

Вид биопрепа овия

Е.coli - М-17

56 15 71

4, 22

78

22 28

Лиофильная сушка

56 19

19

89 2

90

Е.со1Х -К-12

95.6 94

Конвективная высушенная 0

10 нл

100 бО

ЧО

Рие. 1

Бульонная культура

10 нл

Колония на твердой питательной среде 1 нл

Конвехтивная сушка 10 нл

Бульонная культура

10 нл °

Колония на твердой питательной среде

1 нл

Биоконтроль, езультаты анализа, Жн

"Ч Л

1328377

Составитель Л.Борисова

Техред А.Кравчук

Редактор С.Патрушева

Корректор И. Муска!

Заказ 3453/29

Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-прлиграАическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная,