Способ иммуноферментного определения антигенов

 

Изобретение относится к биохимии и иммунологиио Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности способа. Фрагменты чистых противодифтерийных антител смешивают с фосфатно-буферным раствором, вносят в лунки планшета и инкубируют. Планшеты промывают, в лунки вносят дифтерийный анатоксин и инкубируют. После удаления несвязавшегося антигена и промывания планшета в лунки вносят конъюгат и инкубируют. Несвязавшийся конъюгат удаляют, планшеты промывают и в лунки добавляют индикаторный раствор с Результаты реакции оценивают по наличию коричневой окраски в рабочем ряду. 00 со ел

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) А1 (51)4 G 01 N 33 53

OllHCAHHE ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3830997/28-14 (22) 26.12.84 (46) 15,09.87. Бюл. У 34 (71) Пермский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток . (72) Л.И.Райхер, И.И.Райхер, Л.Ю.Смурова, Е,Х.Хазина и С.В.Шабалина (53) 615.373 (088.8) (56) Huesdon J., Aorumea S, Appl, B1ochem. - S.Bioeny., 1981, ч. 3, р. 207-224, (54) СПОСОБ И11МУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ (57) Изобретение относится к биохимии и иммунологии. Цель изобретения — повышение чувствительности и специфичности способа. Фрагменты чистых противодифтерийных антител смешивают с фосфатно-буферным раствором, вносят в лунки планшета и инкубируют. Планшеты промывают, в лунки вносят дифтерийный анатоксин и инкубируют. После удаления несвязавшегося антигена и промывания планшета в лунки вносят конъюгат и инкубируют ° Несвязавшийся конъюгат удаляют, планшеты промывают и в лунки добавляют индикаторный раствор, Результаты реакции оценивают по наличию коричневой окраски в рабочем ряду.

775

50 ,55

1 1337

Изобретение относится к биохимии и иммунологии и может быть использовано для количественного иммуноферментного определения антигенов, Цель изобретения — повышение чувствительности и специфичности метода за счет применения в качестве специфических антител F(ab), -фрагментов иммуноглобулинон, 10

Способ осуществляют следующим образом.

Иммуноферментное определение дифтерийного анатоксина и токсина: н качестве специфических антител для фик- 15 сации на твердой фазе ("подложка") и для конъюгации с ферментом испольэовали Г(аЬ) -фрагменты чистых противодифтерийных антител.

Источником антител служила гиперим-20 мунная противодифтерийная антитоксическая сыворотка лошадиная (титр антитоксина 400 МЕ/мл),. f ab) -фрагменz ты чистых противодифтерийных антител выделяли с помощью щадящего гидролиэа 25 иммунной сыворотки пепсином и последующей сорбцией — элюцией на специфическом иммуносорбенте. Специфическим иммуносорбентом служил дифтерийный анатоксин, сорбированный на геле гид- 30 рата окиси алюминия. Г(аЬ) -фрагменты

z чистых протинодифтерийных антител подвергали дополнительной очистке на сефадексе G-200 для удаления следов растворимого комплекса дифтерийного анатоксина с F(аЬ) -фрагментами чистых противодифтерийных антител, Удельная активность F(ab) -фрагментов чис2 тых протинодифтерийных антител равнялась 400 МЕ/мг азота. Полученный 40 препарат использовали для фиксации на планшете, а также для приготовления на его основе конъюгата с передоксидаэой хрена (производства объединения Биохимреактив ) . Конъюгацию 45 проводили перйодатным методом, Конъюгат очищали на сефадексе G"200 и подвергали лнофильному нысушиванию.

Для постановки реакции использовали планшеты одноразового применения.

В качестве первого компонента, фиксируемого на планшете, использовали

F(ab)2 -фрагменты чистых противодифтерийных антител ("подложка").

Модельным компонентом, являющимся антигенным аналогом дифтерийного токсина, служил дифтерийный анатоксин, который в разведениях наносили в лунки планшета, где он реагировал с поди

JI0KKOH" °

Проявление связавшегося анатоксина проводили с помощью конъюгата тех же F(ab) -фрагментов чистых противодифтерийных антител с пероксидаэой хрена в присутстнии субстратно-индикаторной смеси (перекись водорода + 5аминосалициловая кислота).

Пример, F(ab)2 -фрагменты чистых противодифтерийных антител, разведенные в 0,01 М фосфатно-буферном растворе, рН 7,2-7,4 до концентрации белка 0,01 мг/мп, вносили в лунки планшета. После инкубации в течение о

18 ч при 4-6 С планшеты трехкратно промывали 0,01 M фосфатно-буферным раствором, рН 7,2-7,4, содержащим

0,05Е,Тнина 20 (этот раствор испольэовали на всех последующих этапах постанонки реакции). Затем в сенсибилиэированные лунки вносили серийные разведения дифтерийного анатоксина и инкубировали 1,5 ч при 37 С, После удаления несвязавшегося антигена и трехкратного промывания планшета в лунки вносили конъюгат (F(ab) -фраг2 менты чистых протинодифтерийных антител, меченные пероксидазой хрена в рабочем разведении и инкубировали о

l,5 ч при 37 С, Несвяэавшийся конъю гат удаляли, планшеты трехкратно промынали буферным раствором и в лунки добавляли субстратно-индикаторный раствор. Результаты реакции оценивали визуально по появлению коричневой окраски в рабочем ряду и при отсутствии окраски в контрольных лунках (Г(аЬ) -фрагменты чистых противодифтерийных антител + конъюгат; анатоксин + конъюгат).

Таким образом удается повысить чувствительность предлагаемого способа в 10-20 раэ.

Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я

Способ иммуноферментного определения антигенов, включающий адсорбцию специфических антител на твердой фазе и выявление антигена с помощью конъюгата специфических. антител с ферментом, отличающийся тем, что, с целью повышения чунствительности и специфичности способа,в качестве специфических антител для адсорбции на твердой фазе и для конъюгата с ферментом используют F(аЬ) -фрагменты

2 антител.