Способ получения антибиотика макролида

 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения антибиотика-макролида, называемого PTL-448. Цель изобретения - создание способа получения новых антибиотиковг макролидов, активных в отношении широкого спектра микроорганизмов, в т.ч. mycoplasma. Для получения антибиотика и его производных формулы VCHO HONCCHo.) , Ъ О в S О) где R - водород или ацетил; R - водород ИЛИ микарозил, используют известный штамм Streptomy- ces ambofaciens АТСС 15154, который выращивают в жидкой питательной ереде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в аэробных условиях. Через 24 ч и более после начала культивирования в культуральную среду вводят протилонолид, 5-омикаминозилпротилонолид, 20-оксо-5- -о-микаминозилпротилонолид или 20-гидрокси-5-о-миканозилпротилонолид в концентрации 10-15 мг/100 мл культуральной жидкости. Отделяют фильтрованием жидкую фракцию,экстрагируют целевой продукт и подвергают колоночной хроматографии. Выделяют фракции, содержащие целевой продукт указанной формулы, где RJ - микарозил, и при ; необходимости подвергают гидролизу с получением целевого продукта, где R - водород. 5 табл. (

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (}Щ (lo

SU! ЗСЕИЮЗЩ%

":„13

ВМЗЛИОТЕЫА

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н IlATEHTY но я(сн, 0 82

-р Снз (Н 0

О сн

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3715345/28-13 (22) 28.03.84 (31) 54677/83 (32) 30.03,83 (33) JP (46) 07, 10.87. Бюл. NÓ 37 (75) Сатоси Омура (3Р) (53) 615.77.9.931(088,8) (56) Chem. pharm, Bull.,1980, 29, 1963.

Antimicrob. Agents Chemother, 1981, 2(}, 214.

Biochem. Biophys. Res. Commun.

1982, 107 554 ° где R — водород или ацетил;

R — водород или микарозил, используют известный штамм Streptomyces ambofaciens АТСС 15154, который выращивают в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в аэробных условиях. Через 24 ч и более после начала культивирования в культуральную среду вводят протилонолид, 5-омикаминозилпротилонолид, 20-оксо-5-о-микаминозилпротилонолид или 2015ц 4С 12 P 1/06//(С 2 P 1/06 С 12 R 1:465), (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКАМАКРОЛИДА (57) Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения антибиотика-макролида, называемого

PTL-448 ° Цель изобретения — создание способа получения новых антибиотиковмакролидов, активных в отношении широкого спектра микроорганизмов, в т.ч. mycoplasma Для получения антибиотика и его производных формулы

-гидр ок си-5-о-мик ано зилпр о тило нолид в концентрации 10-15 мг/100 мл культуральной жидкости, Отделяют фильтро-

< ванием жидкую фракцию, экстрагируют целевой продукт и подвергают колоночной хроматографии. Выделяют фракции, содержащие целевой продукт указанной формулы, где Rz — микарозил, и при необходимости подвергают гидролизу с получением целевого продукта, где

R — водород. 5 табл.

134424

CHq сн, О ио ®сна, 0 0 — В

СН (1) 30

О-R< ь (СН, у 0

Изобретение относится к биотехнологии, в.частности к производству антибиотиков, Целью изобретения является разра5 ботка способа получения новых антибиотиков-макролидов, активных в отношении широкого спектра микроорганизмов.

Макролидные антибиотики (PTL-448производные) получают путем аэробного культивирования штамма Streptomyces ambofaciens АТСС 15154. При этом получают два основных продукта ферментации — PTL-448 А и В, и два дополнительных — PTL-448 С и D которью получают гидролитическим отщеплением микарозного сахара от основных продуктов. Зти демикарозиловые продукты наиболее активны, 20

PTL-448-производные представляют собой стабильные белые порошки, Продукты PTL-448 А, В, С и D предположительно имеют следующую структуру: 25!

Величина химического сдвига С-ЯМР-спектра (в CDC1, ) продукта

PTL-448À, млн : 202,3; 171,1; 170,8;

)37,1; 135 9; 133 О; 128,8; 104 2;

101,1; 96,4; 80 5; 79,1; 76,4; 74,8; 40

66,1; 44,0; 42,0; 41,0; 40,7; 38,9;

12,7; 100; 9 5, 45

Величина. химического сдвига С-ЯИР-спектра (в CDC1 ) продукта

PTL-448B, млн: 202, 7; 174,9; 135, 1;

134 8; 133 9; 129 5; 105 О; 102 4;

8,3.

Следующие характеристики являются общими для РТЬ-448 А, С и D, Растворимость: в метаноле, этаноле, ацетоне, этилацетате, хлороформе, бензоле, 8 г слабора створимы в эфир е, н-гек сане, немного растворимы в воде. Цветовая проба: положительная — Драгендорфа, анисовый альдегид-серная кислота, 2,4-динитрофенилгидразин, отрицательная — нингидрин, РеС1, Рейдона-Смита, В табл ° 1 дана физико-химическая характеристика антибиотиков А, В, С и D, PTL-448-производные приведены в табл. 2, !

В приведенной структурной формуле стереохимия не показана, но предполагается, что различные составляющие ,части молекулы имеют ту же стереохимическую конфигурацию, что и протилонолид (лактон в центре), форозамин (лактон слева), микаминоза (сахар справа), Протилонолид-форозаминовая связь предположительно имеет стереохимическую конфигурацию 9- -0-./ -фороэаминила, Наличие аминовых функций в структуре формулы (I) означает, что свободные основания способны образовывать соли. Подобные соли, если они достаточно нетоксичны при употреблении для хемотерапии теплокровных животных, могут использоваться в качестве антибиотиков, K их числу относятся соли„. образованные в реакциях как с органическими, так и с неорганическими солями, такими как сер-. ная, хлористоводородная, фосфорная, уксусная, янтарная, лимонная, молочная, малеиновая, фумаровая, пальмитиновая, холевая, памоевая, слизевая, D-глютаминовая, d-камфорная, глутаровая, гликолевая, фталевая, винная, муравьиная, лауриновая, стеариновая, салициловая, метансульфоновая, бензолсульфоновая, сорбиновая, пикриновая, бензойная и коричная кислота, Пример 1 ° Штамм Streptomyces ambofaciens АТСС 15154 (NRRL

2420) выращивают в 100 мл среды, содержащей, Е: глюкоза 2; мясной эк стракт 0,5; пептон 0,5," сухие дрожжи 0,3"",,хлористый натрий 0,5; углекислый кальций 0>3, при рН 7,0 в о колбе Сакагучи на 500 мл при 27 С в течение 48 ч при встряхивании. Полученный посевной материал переносят в 100 мл ферментационной среды, содержащей, Ж: глюкоза 1,0; сухие дрожжи 1,0; хлористый натрий 0,5;

3 13 углекислый кальций 1,0; азотнокислый натрий 0,1 рН 7,5 в колбе Сакагучи на 500 мл, Культивирование осущест0 вляют при 27 С в условиях встряхивания.

В начале культивирования и спустя 24 и 48 ч в колбу добавляют перуленин в растворе и небольшом количестве этанола по норме 4 мг в колбу. Через,24 ч после начала культивирования в колбу добавляют протилонолид в растворе в небольшом количестве этанола по норме 10 мл на колбу. Культивирование продолжают в течение 72 ч, на протяжении которых рН среды не регулируют.

Мицелий и осадок отфильтровывают от. культуральной среды 100 колб Сака гучи с получением 8,5 л фильтрата, Фильтрат доводят до рН 8,5 добавлением 6н, раствора гидроокиси натрия и дважды экстрагируют тем же количеством бензола, Бензольный слой концентрируют до сухого остатка с получением 1,3 r желтого порошка. Этот йорошковый продукт после суспендирования в хлороформе добавляют в колонку, набитую силикагелем (продукт

У 7734, выпускаемый фирмой "Мерк"), и элюируют смесью хлороформ(метанол) концентрированный водный аммиак (10/1/0,05) ° Каждую фракцию (20 мл) анализируют с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле(продукт

Ф 5554 фирмы "Мерк", проявляющий рас творитель — смесь хлороформ(метанол) концентрированный водный аммиак

15/1/0,05) для выявления тех фракций которые содержат соединение, имеющее значение Rf около 0,26. Эти фрак ции собирают и концентрируют при пониженном давлении с получением 96 мг смеси PTL-448А и PTL-448В в виде белого порошка.

Для дальнейшего разделения этих веществ проводят тонкослойную хроматографию окиси алюминия (продукт

Ф 5550 фирмы "Мерк", проявляющий растворитель — смесь этилацетат/бензол 6/1). Полосы со значениями Ы 0,6 и 0,4 собирают, элюируют этилацетатом и концентрируют с получением

37 мг PTL-448А и 45 мг PTL-448B в ви де белых порошков.

Пример ы 2-4. Пример 1 повторяют с тем отличием, что протилонолид — вещество, добавляемое в качестве исходного материала спустя

44248

55 сутки после начала культивирования, заменяют 5-о-микаминозилпротилонолидом, 20-гидрокси-5-о-микаминозилпротилонолидом или 20-оксо-5-о-микаминозилпротилонолидом, и каждое вещество добавляют по норме 15 мг на колбу, Спустя 3 сут после начала культивирования PTL-448A и PTL-448B образуются и накапливаются в культуральной среде в количествах, указанных в табл. 3. Выходы определяют экстрагированием культуральной среды бензолом, концентрированием экстрак та, растворением культуральной среды бензолом, концентрированием экстракта, растворением осадка в метаноле, а затем по методике примера 1 — разделением и очисткой осадка тонкослойной хроматографией на геле окись алюминия / двуокись кремния и сканированием (УФ-диапазон) на 232 нм.

Пример 5. В 5 мл метанола, подкисленного хлористоводородной кислотой (рН 2) растворяют 100 мг о

PTL-448A и перемешивают при 42 С в течение 2 ч. Добавлением гидроокиси натрия рН реакционного раствора доводят до 9, и после этого раствор экстрагируют бензолом, Осадок растворяют в небольшом количестве метанола и подвергают тонкослойной хроматографии (силикагель, проявление смесью хлороформ(метанол)концентрированный водный аммиак 10/1/0,05).

Продукт со значением Rf около 0,4 собирают и концентрируют с получением

45 мг продукта PTL-448 С в виде белого порошка. Физико-химическая характеристика этого вещества приведена в табл. 1.

Пример 6. При комнатной температуре на протяжении ночи перемешивают 5 мл раствора 01н, хлористоводородной кислоты/метанол (1/3), содержащего 20 мг PTL-448A. После экстрагирования бензолом повторяют методику примера 5 с получением 8,4 мг

PTL-448С.

Пример 7, Методику примера

5 повторяют с тем отличием, что

100 мг продукта PTL-448В растворяют в

5 мл метанола, подкисленного хлористоводородной кислотой до рН 2, Таким образом получают 41 мг продукта

PTL-448D в виде белого порошка, Физико-химическая характеристика этого вещества приведена в табл, 1, 1344248

Антимикробная активность антибиоЯ тиков-макролидов в сравнении со спирамицином представлена в табл. 4.

Кроме того, изучают активность в отношении Mycoplasma с использованием известных методов (бумажный диск дио аметром 8 мм, 37 С, около 48 ч).

Активность антибиотиков в отношении Macoplasma приведена в табл. 5.

Полученные соединения могут быть использованы для лечения или борьбы с бактериальными или микоплазменными инфекциями теплокровных животных, а также людей. 15

С этой целью новые активные ингредиенты смешивают со вспомогательными веществами и носителями, обычно применяемыми в фармакологии и ветерина рии, Подобные носители и всномога- 20 тельные вещества могут быть аналогичными применяемым для приготовления спирамицина или тилозина. Режимы дозировки также могут быть аналогичными используемым в отношении описан- 25 ных антибиотиков. сиз снз

НО 11(СН, --, -О-Б, Q 1 !, СИЗ

Ж3)

»м.«» — » е

Физико-химическая характе PTL-448 А PTL-448 В PTL-448 ристика с PTL-448 D

Элементарный анализ, 7! с

63,73

62,45

64, 78

63,82

9,85

9,18

9,24

9,26

2,92

3,.25

3,97

3,57

Температура плавления, с

108-! 10

С„, Н„Н,01, ! l4" 1!5

Ссg Н go Nz 0<>

91-93

Сд! Я о КуОм

98- 100

СЗ9Н 6рнрО,о

Молекулярная формула

Молекулярная масса

Оптическое вращение

724

910

868

766

+40,0 (с 1, снс!. ) -15,9 +23,2 (С-0,5, СНС ) (С-0,5, СНС1.з) +14,4 снс з) Формула изобретения

Способ получения антибиотика -макролида.общей формулы (I) где R - водород или ацетил;

Rg - водород HJIH микарозил, заключающийся в том, что штамм Streptomyces ambofaciens АТСС 15154 культивируют в жидкой питательной среде, содержащей источники азота и углерода и минеральные соли, в аэробных условиях, затем через 24 ч от начала культивирования в культуральную среду вводят протилонолид, 5-о-микаминозилпротилонолид, 20-оксо-5-о-микаминозилпротилонолид или 20-гидрокси-5-о-миканозилпротилонолид в концентрации 10-15 мг/100 мл культуральной жидкости и выделяют целевой продукт общей формулы (I), где R — микарозил, далее, при необходимости, целевой продукт подвергают гидролизу и получают целевой продукт общей формулы (I)у rpe R водород, 1344248

Таб лица 2

Таблица 3

РТЬ-448

Исходный материал

А В

2 5-о-ИикаминозилМикарозил

10 пр отилон олид

Иикарозил протилонолид

СОСН

20-оксо-5-о20

20

Таблица 4

Испытуемый организм MIC, мкг/мл, продукта PTL-448 Спирамицин

С D APM I APM III

12,5

6ь25 Зе12 1ю56 1 ° 56 6 25

1,.56 1,56 6,25

S. aurus FDA 209P

12,5

6,25 3, 12

Bacillus subtiiis РСЕ 219 1,56 0,78

0178 1156 1э56 lе,56

3,12 . 1,56

1,56 1,56 3,12

3,12

В, cereus IFO 3001

0,4

0,4 0,4 0,4 0,2 0,4

0,2 0,2 0,4

0,4

0,4 0,4

0,4

N,D.

1,56

1,56

0,78

1,56

>1оо >1оо

> 100 > 100 50

>1ОО

>100

>100 >! 00 50

N, D, не определяли

ОН

CHú

ОН

Staphylococcus aurus

АТСС 6538Р

Micrococcus luteus

АТСС 9341

Streptococcus pneomoniae

КВ 165

S, pyagenis КВ 166

Е. coli N-33

Klebsiella pneumoniae

АТСС 10031

Salmonella typhimureum

КВ 20

А ) В

Пример

20-Гидр окси-5-о-микаминозилмикаминозилпротилонолид

0,4 0,4

0,4 .0,2

Выход PTL-448, мкг/мл

1344248

Таблица 5

Диаметр, мм, зоны ингибирования

PTL-448

Испытуемый микроорганизм

В С

Mycoplasma gallisepticum КР-13

29,2 30, 1

Acho leplasma laid1acou

32,6 31,4 33,1 32,0

Составитель Г. Смирнова

Техред А.Кравчук Корректор А, Зимокосов

Редактор С. Пекарь

Заказ 4840/59 Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

rto делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г ° Ужгород, ул, Проектная, 4