Питательная среда для выращивания термофильных бактерий из рода bacillus

 

Изобретение относится к микробиологической промьпиленности и генетическим исследованиям и может быть использовано при создании генетически маркированных штаммов термофильных бактерий для селекции штаммовпродуцентов экстраклеточных ферментов . Целью изобретения является удешевление среды и обеспечение возможности выявления ауксотрофных мутантов термофильных бацилл по всем известным аминокислотам и витаминам. Поставленная цель достигается применением среды, содержащей нижеперечисленные компоненты в следующих соотношениях , г/л: аммоний сернокислый 2,0- 2,3; натрий хлористый 0,31-0,34; аммоний углекислый однозамещенный 0,9- 1,1; калий фосфорно-кислый двузамещенный 1,1-1,3; магний серно-кислый 0,19-0,21; кальций хлористый 0,02- 0,03; трис(гидроксиметил) аминометан (гидрохлорид, рН 7,0) 5,8-6,4; глюкоза 4,8-5,2; вода дистиллированная - остальное. Данная среда может использоваться также для генетических работ с термофильными микроорганизмами нескольких видов, § (Л оо 00 со to ел

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4035600/31 — 13 (22) 30. 12. 85 (46) 23.09. 87. Бюл, !Ф 35 (71) Институт цитологии АН СССР и Всесоюзный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов (72) В. И. Батарин, II. А. Климов, О, А, Андреев и Н. В. Томилин (53) 663. 15 (088. 8) (56) Егорова Л, А,, Цаплина И, А, Влияние состава среди на рост и активность нейтральной протеазы термофильных бактерий Bacillus brevis, Микробиологическая промыщленность, 1970, И 2, с. 3-7.

Rowe J..1., Goldberg G D,, Amelunxen R. Е. Development of defined and minima1 media for the

growth of Bacillus stearothermophilus. — J. Baoteriol. 1975, v, 124, р, 279-284. (54) ПИТАТЕ11ЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВА, НИЯ ТЕРМОФИЛБН1>1Х БАКТЕРИЙ ИЗ РОДА

BAG I I, t à ã, „„SU„„1339125 А1 (50 4 С 12 N 1/20 // (С 12 N 1/20, С 12 R 1:07) (57) Изобретение относится к микробиологической промьпаленности и генетическим исследованиям и может быть использовано при создании генетически маркированных штаммов термофильных бактерий для селекции штаммовпродуцентов экстраклеточных ферментов, Целью изобретения является удешевление среды и обеспечение возможности выявления ауксотрофных мутантов термофильных бацилл по всем известным аминокислотам и витаминам, Поставленная цель достигается применением среды, содержащей нижеперечисленные компоненты в следующих соотношениях, г/л: аммоний сернокислый 2,0- д е

2, 3; натрий хлористый О, 31-0, 34; аммоний углекислый однозамещенный 0,91,1; калий фосфорно-кислый днузамещенный 1,1-1,3; магний серно-кислый С

0,19-0,21; кальций хлористый 0 020,03; трис(гидроксиметил) аминометан (гидрохлорид, рН 7,0) 5,8-6,4; глюкоза 4,8-5>2; вода дистиллированная остальное. Данная среда может использоваться также для генетических ра- © бот с термофильными микроорганизмами нескольких видов, 1 13 39!

1!эобретение относится к микробиологической промышленности и к генетическим исследованиям и может быть использовано при создании генетичес5 ки маркированных штаммов термофильных бактерий, для создания штаммонпродуцентов экстраклеточных ферментон °

Цель изобретения — удешевление среды и обеспечение воэможности получения ауксотрофных мутантов, Изобретение заключается в том> что среда для выращивания термофильных бацилл содержит глюкозу, минеральные компоненты и воду н следующем соотношении компонентов, г/л:

Аммоний серно-кислый 2,0-2,3

Натрий хлористый 0,31-0,34

Аммоний углекислый одноэамещенный 0,9-1 1

Калий фосфорнокислый днуэамещенный 1,1 — 1

Магний серно-кислый О,!9-0

Кальций хлористый 0,02-0

Трис(гидроксиметил)— аминометан (гидрохлорид) 5, 8-6

Глюкоза 4, 8-5

Вода дистиллированная До l л

Среда пригодна для обнаружения и идентификации ауксотрофных мутантов, для поддержания роста термофильных 35 бацилл, для селекции штаммов-продуцентов зкстраклеточных ферментов, Количественное и качественное со,3

25 ,03,4

30 четание компонентов среды позволяет обеспечивать рост термофильных бацилл в отсутствие аминокислот и витаминов, Среда менее трудоемка в приготовлении, чем прототип вследстние более простого состава, а также значительно дешевле из-за отсутствия в ее составе аминокислот и нитаминов, Пример 1, Для получения среды смешивали стерильные растворы компонентов со стерильной водой в следующей последовательности: вода дистиллированная 9 18,3 мл; аммоний серно-кислый 107. — íûé раствор 21,5 мл; натрий хлористый 107.-ный растнор

3,3 мл; аммоний углекислый одноэамещенный 107. — ный раствор 10,0 мл; калий фосфорно-кислый двузамещенный

107-ный раствор 12,0 мл; трис-HCT рН 7,0, 1,1 раствор 20,0 мл; магний серно †кисл 107-ный раствор 2,0 мл;

25 ? кальций хлори стый 57-ный ра створ

0,4 мл; глюкоза 407-ный раствор

12,5 мл, Далее клетки термофильных микроорганизмон следующих видов:

Bacillus thermononliguefaciens TRI/I (ЦМПМ вЂ” В2 5 75 )

Bacillus thermononTiguefaciens

ДГ-9 (ЦМПМ- В 29 45 )

ТК!

Пример 2, Клетки Bacillus

thermononliguefaciens ТРI/I подвергали ноздействию N-метил-N -нитро-N> нитроэогуанидина, после чего нысевали на чашки Петри со средой, приготовленной, как в примере 1, но содержащей дополнительно 5 г/л пептона и

5 г/л дрожжевого экстракта. После инкубации в течение 16 ч при 65 C выBacillus calidus

Bacillus subdenticulatus Matzuchita TR<

Bacillus reductans

Feirer ТК

Bacillus thermoalimentophilus Weinzizl TR92

Bacillus tos tus TR9>

Bacillus stearothermophilus TRll; TR23;

TR25

Bacillus michaelisi

Prickett TR12

Bacillus nitrosus

Campbell ТК15 высе вали на чашки Петри, содержащие ту же среду с добавлением очищенного агара до 20 г/л, После инкубации в о течение 20 ч при 65 С выросшие на поверхности агара колонии еще 4 раза пересевали на свежие чашки с агариэованной средой, инкубировали по .20 ч при 65 С для истощения пищевых компонентов, которые могли находиться в первичном посевном материале. Наличие роста определяли визуально по появлению колоний.

Аналогичный опыт был проведен при температуре инкубации 70 С, В результате было показано, что рост всех исследуемых штаммов не был поданлен при длительном культивировании на новой среде при 65 — 70 С, тогда как известная среда описана только как среда для культивирования Bacillus

stearothermophilus u Bacillus coagulans при 60 С.

13391

Пример 4 ° Для приготовления 45 среды испольэовали следующий состав компонентов, г/л: (ИН ) ВО 2,4;

NaCl 0,35; NH HCO 1,2; К НРО 1,4;

MgSO 0,22; СаС1 0,04; трис(гидроксиметил) аминометан НС1 6,5; глюкоза 5,3; вода дистиллированная до 1 л.

Способ приготовления питательной среды тот же, что н примере 1.

Вскоре после приготовления питательной среды было отмечено выпадение осадка солей, Использование агариэонанной среды указанного состава привело к резкому замедлению скорости роста нсех исследованных нидов росшие на поверхности агара колонии перепечатывали на чашки Петри с той же средой, не содержавшей петона и дрожжевого экстракта. Путем добав5 ления к среде различных аминокислот полученные мутанты были идентифицированы следующим образом: ауксотрофные ло гистидину 8 штаммов ауксотрофн.re no аспарагину 1 штамм ауксотрофные по орнитину 1 штамм.

Таким образом, предлагаемая среда 15 дает воэможность получать различные ауксотрофные мутанты термофильных бактерий, в том числе мутанты, ауксотрофные по гистидину, что ненозможно при использовании известной среды, 2р

Пример 3, 1 мл суспензии клеток Bacillus thermononliguefaciens

ТР1/11 подвергнутых воздействию N-ме" тил-М -нитро-N-нитрозогуанидина, разводили н 100 раз средой, приготовлен- 25 ной, как в примере 1, но содержащей вместо глюкозы 5 г/л казеина. Клетки помещали н 100 пробирок, которые инкубиронали н течение 16 ч при 65 С.

Содержимое пробирки с максимальным з0 гидролизом казеина рассеинали на чашки Петри, содержавшие предлагаемую среду с добавлением 5 г/л казеина и

20 г/л агара. После инкубации в течение 20 ч и последующего просмотра

35 нескольких тысяч колоний был обнаружен мутант, продуцирующий на 20Х больше экстраклеточной протеаэы, чем исходный штамм, т ° е. среда может быть использована для селекции штаммов микроорганизмов, продуцирующих повышенное количество зкстраклеточных гидролитических ферментов, в данном

Случае — протеаэ.

4 бактерий. Данное замедление роста выражалось в том, что после 1-х суток инкубации при 60-70 С наблюдался рост бактерий в виде точечных микроколоний, на 2-е сутки инкубации размер данных микроколоний не увеличивался ° При пересеве микроколоний на свежие чашки с указанной средой роста бактерий не наблюдали, Таким образом, увеличение концентрации компонентов среды приводит к выпадению части из них в осадок, что делает среду практически непригодной для роста микроорганизмов при повышенной температуре.

Пример 5 Для приготовления среды испольэовали следующий состав компонентов, г/л: (NH<)> SO 1,9;

NaCl 0,30; МН4нсоз 0,8;3 К2НРОФ 1,0;

MgSO 0,18; СаС1 0,01; трис(гидрак2 симе тил) аминоме т ан (гидр о хлорид, рН 7,0) 5,7; глюкоза 4,7; вода дистиллированная до 1 л.

Способ приготовления питательной среды тот же, что и в примере I. Использование агаризованной среды данного состава привело к тому, что скорость роста бактерий заметно уменьшилась, и колонии микроорганизмов вырастали только к 3-м суткам инкубации при 60-70 С, однако, поскольку к данному сроку инкубации наблюдалось также высыхание агара на чашках, то выросшие колонии были нежизнеспособны, Таким образом, уменьшение концентраций компонентов питательной среды приводит к резкому замедлению скорости роста бактерий, что затрудняет, а в случае использования агаризованной среды делает невозможным генетическую работу с термофильными микроорганизмами.

Формула изобретения

Питательная среда для выращивания термофильных бактерий из рода Bacil-

lus содержащая глюкозу в качестве источника. углерода, источники азота, натрий хлористый, калий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, кальций хлористый и дистиллированную воду, о т л и ч а ю щ ая с я тем, что, с целью удешевления среды и обеспечения воэможности получения ауксотрофных мутантов, среда содержит аммоний серно-кислый и аммоний углекислый однозамещенный в

133912 >

Калий «1>ос<Ьор««окислый дву«аме1,1— - 1,3 щенный

".1агний серно-кис0,19-0,21

0,02-0,03

5,8-6,4

0,9-1, 1

Остальное ванная

Составитель Е. Воробьева

TpxpeII М.Дидык Корректор И. Зрдейи

Редактор А, 1ца««д«>р

Заказ 4183/!7 1 ««раж 499

ВНИИ!IИ Г >сударсTIIp«IIIÎI комитета СССР ио дел;«01 и «обреTPI«èé и открытий

1 130 3В>, 11 с ° « I, iII — 3>, Раущс кая наб., д. 4/5

l1O;I11IICI«>e

Производств«««««i — 1«« .««I«ра1>«1>«««кi>p ««ред««риятие, I . У>к«>р«>п, . I. Проект««ая, качестве источников азота и дополнив тельно три с (гидрок симе тил) аминоме та«« (гидрохлорид) при следующем 0001!«0«I«рнии компонентов, г/л:

Глюкоза 4, R- >,2

Аммоний сернокислый 2,0-2,3

Натрий хлористый 0,31-0,34

Аммоний углекислый однозамещенный

JIbI É

Кальций хлористый

Трис(гидроксиметил) аминометан (гидрохлорид)

Йода дисти.«пиро