Штамм мyсорlаsма рnеuмоniае 1, используемый для получения диагностикумов и диагностических иммунных сывороток

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может найти применение при получении диагностических препаратов. Цель изобретения - новый антигенноспецифический, со сниженной вирулентностью, высокоурожайный штамм Mycoplasraa pneumoniae. Штамм получен методом клонироваШ1я исходного штамма FH-MO, депонирован в коллекции микроорганизмов НШ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи под номером К Штамм № I используют для получения антигенов , применяемых для-приготовления диагностикумов, для постановки РСК и PHrAs получения иммунньк диагностических сьшороток. 5 табл. колонии, .высевают их на жидкие среды . Культуры из отдельных колоний вторично фильтруют, сеют на плотные среды и вторично полученные из отдельных колоний культуры считают клоном. Среди них отбирают такие, которые отличаются слабой выраженностью цилиостатического действия и высокой репродуктивной активностью при росте на поверхности стекла под слоем жидкой питательной среды. Полученный штамм Mycoplasma pneumoniae депонирован в коллекции культур ВНИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи /лаборатория микоплазм и L-форм ) под № 1 и .характеризуется следующими признаками . 00 со

СООЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОЮЕТЕНИИМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4011621/28-13 (22) )4.01.86

{46) 30.10.89. Вюл. № 40 (71) Всесоюзнйи научно-исследовательский институт гриппа (72) В.В. Лисин и А,А. Смородинцев (53) 576.8.097(088.8) (56) Колесников Л.В. и др. в сб.:

"Проблемы гриппа и вирусных ОРЗ".

Л., 1974, т. 7, с. )32-137.

Bergey s mannual of determinative bacteriology, 8 ed Eds Buchman R.

et аl. Baltimore, 1975, Лисин В.В., Демяник И.В., Радченко Н,А. в кн.: Иммунология вирусных и микоплазменных инфекций, Сб, тр.

Казахского НИИЭМБ. Алма-Ата, 1983, 136-139.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в вакцинно-сыворотном деле для получения диагностикумов и специфических диагностических сывороток.

Цель изобретения - создание штамма

Mycoplasma pneumoniae, обладающего высокой урожайностью, антигеноспецифичностью, сниженной вирулентностью.

Для получения штамма культуру исходного штамма РН-l)Q пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Выделенные культуры выращивают на плотной питательной среде Хейфлика, отбирают отдельные

„„80„„3 336561

С 12 N 1/20, А 6) К 39/02, 39/40,//С 12 И 1/20, С 12 К 1:35

2 (54) ИЕА) Я NYCOPLASNA РИЕЦИОИТАЕ 1, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕ)Б)Я Я4АГНОСТИКУМОВ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИКНУННЫХ СЫВОРОТОК (57) Изобретение относится к мецицинской микробиологии и может найти применение при получении диагностических препаратов„ Цель изобретения— новый антигенноспецифический, со сниженной вирулентностью., высокоурожайный штамм Mycoplasma pneumoniae, Штамм получен методом клонирования исходного штамма FH-110, депонирован в коллекции микроорганизмов НИИ ЗМ им. Н.Ф. Гамалеи под номером ). Штамм

¹ 1 используют для получения антигенов, применяемых для-приготовления диагностикумов, для постановки РСК и РНГА, получения иммунных диагностических сывороток, 5 табл.

1 колонии,,высевают их на жидкие среды. Культуры из отдельных колоний вторично фильтруют, сеют на плотные среды и вторично полученные из отдельных колоний культуры считают клоном. Среди них отбирают такие, которые отличаются слабой выраженностью цилиостатического действия и высокой репродуктивной активностью при росте на поверхности стекла.под слоем жидкой питательной среды.

Полученный штамм Мусорlазша pneumoniae депонирован в коллекции культур ВНИИЭМ им. Н.Ф, Гамалеи (лаборатория мнкоплазм и Ь-форм ) под ¹ 1 и ,характеризуется следующими признака-

MH ° 1336561

Морфологические признаки.

На агаризированной питательной среде Хейфлика колонии развиваются на 5-й день. Они имеют плотный sep5 нистый центр и прозрачную периферию.

Клетки полиморфные в виде слабо ветвящихся нитей, "шаров", "зерен", что является типичным для культур микоплазмы пневмонии. 1G

Культуральные и биохимические свойства, Растет в аэробных и анаэробных условиях. Иетиленовый синий в кон.— центрации 0,001-0,005% и ацетат таллия в концентрации О, 05% рост не ингибирует. Разлагает в аэробных условиях глюкозу, мальтозу, ксилозу, маннозу до кислоты, не разлагает аргинии и мочевины при росте на питатель- 20 ных средах. Вызывает быстрый бетагемолиз эритроцитов морской свинки, обладает способностью к reMapсорбции.

В отсутствии лошадиной сыворотки и

- дрожжевого экстракта не растет на 25 среде Хейфлика.

Антигенная структура.

Штамм перекрестно реагирует с антисывороткой к штаммам FH Р 13В и

780 в реакции ингибиции метаболизма и реакции нейтрализации до титра. Меченая иммунная сыворотка в реакции эпифлюоресценции реагирует со штаммом 1 до тирра, Антисыворотка к штам- . му ГН реагирует с диагностикумами иэ

35 штамма 1 до титра в реакции связывания комплемента и непрямой гемагглютинации. При обратной постановке реакций, т,е. когда диагностикумы для

РСК и РНГА готовят из штамма FH u используют для их проверки антисыворотку к штамму 1, они также идут до титра сыворотки.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами. 45

Пример 1. Использование штамма Ф 1 для приготовления диагностикума из микоплазмы пневмонии для РСК, Производственный штамм микоплазмы пневмонии, предварительно прошедший контроль на бактериальную стерильность, специфичность, отсутствие посторонних микоплазм, биологическую активность, засевают в литровые матрацы (типа бутыли Новицкого) с 75 мл среды Хейфлика (200 мл бульона из триптического перевара говяжьего сердца, 20 мл дрожжевого экстракта, 50 мл лошадиной сыворотки, глюкозы до 1%, фенолового красного до 0,002%, хлорида натрия до О, 5%, насыщенного спиртового раствора холестерола до

0,1%, пенициллина до 1000 ед/мл, пН 7,8). Инкубируют при 35ОС, подщелачивая среду до рН 7,8 раствором гидроокиси натрия каждые 6-18 ч, Культуру выращивают 5 дней до образования равномерного слоя микоплазмы ,на стеклянном дне матраца под слоем питательной среды. Стерильным резиновым шпаделем снимают слой микоплазм со дна матраца в жидкую фазу культуры и используют в качестве посевного материала для получения серии антигена, Посевной материал вносят в объеме

6 мл в 300 мл среды Хейфлика,которую затем распределяют по 75-80 мл в литровые матрацы. Посевы выращивают, как описано ранее, После образования достаточного слоя микоплазм на дне матраца питательную среду отсасывают, Слой отмывают от остатков питательной среды 3-кратным споласкиванием буферыь м изотоническим раствором рН 7,6 и снимают со дна матраца резиновым шпаделем в свежую порцию такого же раствора. Полученный материал контролируют на бактериальную стерильность, содержание микоплазм (по мутности и биологической активности).

Он имел мутность 170 ед.П*.СК, биологическую активность 10 K0E мл о и был бактериологически стерильным.

Клетки микоплазмы пневмонии разрушают ультразвуком при 16 кГц в течение 20 мин. Полученный антиген в разведении 1:10 не об.падает антикомплементарными и гемолитическими свойствами, при определении антигенной активности методом "шахматного" титрования она составляет 220 ед,Антиген смешивают в соотношении 1:1 с 2%-ным раствором желатина на 20%-ной сахарозе, фасуют в ампулы, лиофильно высушивают и запаивают под вакуумом.

Готовый препарат имеет антигенную активность 110 ед,, в разведении l:5 не гемолитичен и антикомплементарен, не содержит жизнеспособных микоплазм в объеме 5 мл.

Пример 2. Использование штамма 9 1 для приготовления диагностикума из микоплазмы пневмонии для РНГА.

Дпя получения серии антигена производственный штамм засевают, выращивают в жидкой питательной среде Хейфлика, получают взвесь отмытых от

1336561

40 Штамм Иусор1asma pneumoniae 1 (коллекция микроорганизмов НИИЗИ им, Н.Ф. Гамалеи), используемый для получения диагностикумов и диагносых микоплазм в объеме 2 мл. тических иммунных сывороток, Таблица 1

Реэулътаты перекрестного вэаимодействиа раэличных штаммов мнкоплаэмы пневмонии с антисыворотками к гомо- и Гетерологичным штаммам в различных реакциях

1Итаммы Титры реакций при постановке их с антисыворотками к штаммам

FH 780 138 1 FH 780 138 FH FH

) FH

Р, нейтралиэации РНГА PCK

P. ннгибиции метаболиэма

Р, эпнфлшоресценцни

1 6400 3200 6400 400

FH 6400 3200 6400 200

780 6400 3200 6400 400

16 8 16 (4 3200 1280

16 8 16 44 3200 1280

16 8 16 <4

П р и и е ч а н и е. — типовой штамм (АТСС 15331); + — свелкевыделенный штамм среды клеток, контролируют ее и обрабатывают ультразвуком, как в примере

1. Взвесь клеток обладает мутностью

19Î ед. стандарта ГИСК, биологической активностью 10" КОЕ мл. Анти- ген в разведении 1:10 не обладает гемолитическими и антикомплементарными свойствами, антигенная активность его составляет 250 ед. Антиген не содержит жизнеспособных микоплазм (определено посевом 5 мп на

50 мл среды Хейфлика). Сенеибилизируют акролеинизированные. эритроциты антигеном в присутствии бидиазотированного бенэидина и лиофильно высушивают в ампулах в растворе пептона, после чего запаивают под вакуумом.

Полученный препарат выявляет в реферес-сыворотке антитела в том же 20 титре, что и предшествующие серии (1:2560), специфичен при постановке контрольных опытов с сыворотками крови иммунизированных и интактных животных, не содержит жизнеспособных микоплазм в объеме 2 мп. Эритроциты оседают за 1,5-2 ч при постановке реакции с неспецифической сывороткой.

Пример 3. Приготовление анти- 30 гена из штамма Р l для получения диагностических иммунных сывороток.

Взвесь отмытых клеток микоплаэмы пневмонии получают с использованием приемов, описанных в примере 1, По- 35 лученная взвесь содержит 10 КОЕ мл

5с микоплазмы пневмонии и имеет мутность 160 ед. ГИСК, не содержит бактерий в объеме 2 мл ° Для инактивации выдерживают взвесь отмытых клеток при -5-10 С в течение 14 дней, после чего вторично контролируют на бактериальнущ. стерильность и наличие жиэнеспособн

Серии, прошедшие соответствующий контроль, используют для получения иж унных сывороток. Полученные иммунные сыворотки вызывают появление эо- ны задержки роста 4--12 мм в реакции ингибиции роста микоплазмы, в реакции ингибиции метаболизма 1:32001:12800, в реакции эпифлюоресценции

1:8-1:16 и в реакции связывания комплемента 1:1280-1:5120. Для получения длительно хранящегося препарата антител сыворотки в ампулах лиофильно высушивают и эапаивают под вакуумом.

Диагностикуиы и диагностические сыворотки, полученные с использованием штамма 1, стабильны прн хранении при 4 С в течение 2 лет (срок наблюдения).

Результаты сравнитель oãо испыта-ния диагностикумов и диагностических сывороток представлены в табл, 1-5.

Штамм 1 отличается низкой внрулентностью для человека, Прн инфицировании людей через дыхательные пути в массивной дозе вызывает у высокочувствительных людей лишь слабо выраженные кратковременные симптомы заболевания, Штамм обладает высокой репродукционной активностью: через 5 дней культивирования дает урожай в 300 раэ выше, чем известный штамм, в условн:;x выращивания на поверхности матраца под слоем питательной среды.

Формула и э о бр е т е н и я

1336561

Таблица 2

Результаты испытания специфичности иммунных сывороток, полученных к штамму 1

Серологические Титры реакций при постановке их с антигенами, реакции приготовленными из штаммов:

200

6400 3200 3200 3200

8 8 8

1280 1280

3200 3200

Т а б л и

Результаты. сравнительных испытаний диагностикумов, приготовленных из штаммов 1 и FH при исследовании сывороток крови лабораторных животных ц а 3

Средняя (Ne) титра и ее доверительный в реакциях

Штаммы Объект исследования

Кол-во проб антител интервал

РНГА

РСК

Незараженные кролики и хомяки

FH

FH

Зараженные мыши

Зараженные и вакцинированные хомяки

10 (<5-20)

10 (< 5-20) 15

Вакцинированные кролики

320(160-1280)

320(160-1280) 18

Таблица 4

Результаты сравнительных испытаний диагностикумов, приготовленных из штаммов 1 и FH, в серологических реакциях (PCK и РНГА) Штамм Время отбора сыворотки крови у волонтеров

Средняя (Ме) титра антител и ее доверительный интервал

Кол-во проб

PCK

PHГА

Волонтеры группы 1

FH До инфицирования микоплазмой пневмонии

FH 10(с10-20) 10((10- 20) 20 (<5-20)

20 (10-20) 18

Посл е инфи ци р ов а ни я микоплазмой пневмонии

410((10- <1 О)

<10(с10- (! О) 40 (20-80)

40 (20-80) 18

Волонтеры группы 2

До инфицирования микоплазмой пневмонии

40 (20-1 60) 40 (20-160) l9

FH

Йосле инфицирования микоплазмой пневмонии

160 (80-320)

160 (80-320) 19

P.èíãèáèöèè метаболизма

P.нейтрализации

P.ýïèôëþoðåñценции

РСК

РНГА

1 FH 780 1ЗВ N.гоминис Н-37

15 с 10 (С10-с10) c5 (5-10)

16 10 (<10-<10) i5 (5-10)

35 <5 !

35 (5

) 336561

Таблица

Результаты сравнительных испытаний диагностикумов, приготовленных из штаммов 1 и FH, при обследовании парных сывороток людей, больных ОР3 и острой пневмонией

Контингент Кол-во

Штамм парных сывороток

Составитель В. Дроздов

Редактор Г. Федотов Техред М.Моргентал Корректор C Ч рни

Заказ 8029 Тираж 501 Подпис ное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Mocxsa, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

FH Дети

FH Взрослые

124

124

103

103

Число лиц (X) с положительной с ер ок о ив ерс и ей (нарастание титра антител в 4 и более раз) 3,3

3,5