Способ изготовления сыворотки против сибирской язвы

 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к производству ветеринарных биологических препаратов. Цель изобретения повышение специфической активности сыворотки, упрощение и ускорение способа ее получения, более эффективное использование продуцентов. В качестве антигена для гипериммунизации лошадей-продуцентов используют вегетативную культуру вакционного бескапсульного сибиреязвенного штамма СТИ 1. Гипериммунизацию проводят в два этапа: производят 5 инъекций антигена параллельно подкожно в возрастающих дозах от 0,4 - 0,6 до 4,0 6,0 млрд. микробных клеток и внутрикожно в постоянных дозах 0,4 0,6 млрд. клеток, на втором этапе производят 8 инъекций антигена подкожно в возрастающих дозах от 8,0 12,0 до 78,0 126,0 млрд. клеток. Интервал между инъекциями 3 4 дня. Через 7 9 дней после окончания гипериммунизации производят крововзятие от каждого продуцента. Отделяют сыворотку общепринятым методом. Сыворотку используют для профилактики и лечения сибирской язвы. Препарат животным вводят подкожно или внутримышечно. Полученная сыворотка обладает высокой протективной и терапевтичной активностью, широким спектром защитного действия в отношении разных вирулентных сибиреязвенных штаммов. Специфическая активность препарата сохраняется в течение 3,5 лет после изготовления. 3 табл.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к производству ветеринарных биологических препаратов, и может найти применение в ветеринарной практике для лечения и профилактики сибирской язвы животных. Целью изобретения является повышение специфической активности сыворотки, упрощение и ускорение способа ее получения, более эффективное использование продуцентов. П р и м е р 1. Приготовление антигена для гипериммунизации. Споровую культуру штамма СТИ-1 высевают во флаконы с МПБ (рН 7,0 ± 0,2) в количестве 0,2-0,3 см³ и посевы инкубируют в течение 18-20 ч при 37-38^оС. По истечении этого срока полученную бульонную культуру проверяют макроскопически и микроскопически на чистоту и типичность роста. После проверки матричной культуры проводят посевы ее в количестве 5-10см³ в стеклянные бутыли-четверти, заполненные на 2/3 объема МПБ. Посевы инкубируют в течение 18-22 ч при 37-38^оС. Выращенную микробную культуру по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича доводят до концентрации 500-100 млн. микробных клеток/см³, проверяют макроскопически и микроскопически на бактериальную чистоту, типичность, после чего используют для гипериммунизации продуцентов для первых шести инъекций. Для последующих инъекций используют концентрированную бактериальную суспензию штамма СТИ-1. С этой целью полученную бактериальную суспензию штамма СТИ-1 с концентрацией клеток 500-100 млн./см преципитируют калийными квасцами. Квасцы добавляют в количестве 0,1 мас. в виде 4%-ного раствора. Смесь отстаивают в течение 20-30 мин и при помощи сифона отсасывают часть отстоявшейся жидкости (30-40% ). Концентрированный остаток микробных клеток (см³) используют для дальнейшей гипериммунизации продуцентов. Гипериммунизация лошадей. Лошадей 3-6 лет массой не менее 350 кг гипериммунизируют по схеме, представленной в табл.1. При этом суточную бульонную культуру штамма СТИ-1 продуцентам вводят в объемах 1, 2, 4, 5, 10, 20 см³ подкожно (инъекции N 1-6) и 1 см³ внутрикожно (инъекции N 1-5), а концентрированный антиген в объемах 40, 50, 60, 80, 100, 120, 150 см³ (инъекции N 7-13) подкожно. В процессе обработки схемы гипериммунизации лошадей установлено, что введение антигена в дозах, превышающих максимальные, вызывает резковыраженную нежелательную ответную реакцию организма продуцентов (сильное угнетение, повышение температуры тела, иногда гибель продуцентов). Введение лощадям антигена в дозах меньших, чем минимальные, приводит к получению противосибиреязвенной сыворотки специфической активности, уступающей сыворотке, полученной при использовании вирулентных сибиреязвенных штаммов. Взятие крови. Через 7-9 дней после окончания гипериммунизации производят первое "рабочее" крововзятие от каждого продуцента. Второе и последующие крововзятия производят через 7-9 дней после введения "рабочей " дозы антигена (41,6-67,2 млрд. микробных клеток), которые вводят через 3-4 дня после очередного крововзятия. Порядок взятия и обработки крови. Кровь от продуцентов берут в градуированные стерильные бутылки емкостью 15-20 л. Первое крововзятие производят из расчета 8-10 см³, а последующие из расчета 16-20 см³ на 1 кг массы лошади. Для отделения сыворотки применяют общепринятый метод цитрирования крови с последующим сепарированием и дефибринацией плазмы. Контроль сыворотки на специфическую активность. Контроль сыворотки на активность проводят на трех кроликах, которых после внутривенного введения сыворотки в дозе 2 см³ на 1 кг живого веса заражают культурой вирулентного сибиреязвенного штамма Ч-7 в дозе 10 ЛД₅₀. При выживании минимум двух кроликов из трех привитых сыворотку считают активной. Сыворотка не теряет своей активности в течение 3,5 лет хранения. П р и м е р 2. Сыворотку используют для профилактики и лечения сибирской язвы. Препарат животным вводят подкожно или внутримышечно в дозах, указанных в табл.2. Превентивную активность сывороток определяют в опытах на кроликах и овцах количественным методом в сравнении с активностью сыворотки, полученной с использованием в качестве антигена культур 12 вирулентных сибиреязвенных штаммов, т. е. полученной по используемой в настоящее время технологии. Сыворотки (каждую в отдельности) кроликам вводят внутривенно в неразведенном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8 в дозах из расчета по 2 см³ на 1 кг массы кролика, овцам подкожно в дозах 20, 10, 5 и 2,5 см³ на 1 голову. Одновременно привитых сывороткой и контрольных (непривитых) животных заражают культурой вирулентного сибиреязвенного штамма Ч-7 подкожно в дозе 20 ЛД₅₀. На каждую дозу сыворотки и в контроль берут не менее четырех животных. Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 10 сут, после чего окончательно учитывают результаты. ЕД₅₀ сывороток рассчитывают по методу Кербера в модификации Ашмарина (Ашмарин И.П. Воробьев А.В. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л. 1962). В результате испытаний установлено, что в опытах на кроликах сыворотка, изготовленная по предлагаемому способу, активнее сыворотки, полученной с использованием культур вирулентных штаммов (ЕД₅₀ соответственно 1,0 и 1,2 см³), а в опытах на овцах значительно превосходит по активности последнюю (ЕД₅₀ соответственно 2,97 и 7,07 см³). Терапевтическую активность сывороток определяют количественным методом в опытах на кроликах. С этой целью сыворотки кроликам вводят внутривенно в неразведенном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8. Через 24 ч привитых сыворотками и контрольных (непривитых) животных заражают культурой штамма Ч-7, как при проверке превентивных свойств. На каждую дозу сыворотки и в контроль берут не менее четырех кроликов. Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 10 сут, после чего по методу Кербера в модификации Ашмарина рассчитывают ЕД₅₀ сывороток. Результаты испытаний показали, что сыворотка, изготовленная по предлагаемому способу, по терапевтической активности превосходит сыворотку, полученную с использованием вирулентных сибиреязвенных штаммов (ЕД₅₀ соответственно 1,4 и 2,0). П р и м е р 3. Количественным методом (описание метода дано в примере 2) проверены превентивные свойства сывороток, полученных после двенадцатой инъекции антигена (доза 62,4-100,8 млрд.микробных тел), тринадцатой инъекции антигена (доза 78,0-126,0 млрд. микробных тел) и дополнительной четырнадцатой инъекции антигена (доза 93,6-151,2 млрд. микробных тел). Всего проведено 3 опыта, в которых использовано 216 кроликов. Установлено, что сыворотка, полученная от продуцентов после двенадцатой инъекции антигена, менее активна, чем сыворотка, полученная после тринадцатой инъекции (ЕД₅₀ соответственно 2,0 и 1,0 см³). Последующая инъекция антигена не приводит к повышению активности полученных от продуцентов сывороток (ЕД₅₀ остается на прежнем уровне, 1,0 см³ ). Следовательно, оптимальная схема гипериммунизации лощадей-продуцентов предусматривает 13 инъекций антигена. П р и м е р 4. Оценка биологических свойств сыворотки (по определению спектра защитного действия в отношении разных штаммов возбудителя болезни). Спектр защитного действия сывороток, полученных предлагаемым способом и с использованием вирулентных сибиреязвенных штаммов, против 12 вирулентных штаммов возбудителя антракса изучают в опытах на кроликах. С этой целью кроликам внутривенно вводят испытуемые сыворотки (каждую в отдельности) в дозе 2 см³ на 1 кг массы. Одновременно привитых и контрольных (непривитых) животных заражают культурами вирулентных сибиреязвенных штаммов подкожно в дозе ЛД₅₀. Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 10 сут, после чего учитывают опыт. Результаты опытов представлены в табл.3. Таким образом, проведенные испытания показали, что предлагаемый способ изготовления сыворотки против сибирской язвы обеспечивает получение более эффективного препарата, чем известные способы, с высокой протективной и терапевтической активностью, широким спектром защитного действия в отношении разных вирулентных сибиреязвенных штаммов, сохраняющего свою специфическую активность в течение 3,5 лет после изготовления. Применение в качестве антигена культуры одного штамма СТИ-1 по указанной схеме позволяет повысить специфическую активность противосибиреязвенной сыворотки, значительно упростить и удешевить технологию ее производства, исключить возможность заражения сибирской язвой людей и обсеменения окружающей среды спорами вирулентных штаммов антракса, в более короткие сроки (43-57 дней вместо 59-109 дней) получить сыворотку, значительно более эффективно использовать продуценты (очередные крововзятия через 10-12 дней вместо 31-80).

Формула изобретения

СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ путем гипериммунизации продуцентов антигеном из штамма СТИ-1 с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения специфической активности сыворотки, ускорения и упрощения способа, гипериммунизацию проводят в два этапа, при этом на первом этапе антиген вводят пятикратно, параллельно подкожно и внутрикожно, а на втором восьмикратно подкожно в возрастающих дозах от 8,0 12,0 до 78,0 126,0 млрд. микробных клеток с общим интервалом между введениями 3 4 дня, причем на первом этапе подкожное введение осуществляют в возрастающих дозах от 0,4 0,6 до 4,0 6,0 млрд. микробных клеток, а внутрикожное в дозе 0,4 0,6 млрд. микробных клеток.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2