Штамм аzотовастеr снrоососсu @ для получения бактериального удобрения под томаты

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Оно представляет собой штамм несимбиотического азот-фиксатора Azotobacter chroococcum ЦМПМ В-3344, способный специфически прикрепляться к корням томатов и вступать с томатами в ассоциативный симбиоз. Бактериальное удобрение с торфяным наполнителем, полученное на основе этого штамма, повышает урожай томатов на 29% и обладает долговременным действием. Штамм характеризуется повьш1енной выживаемостью клеток в торфяной среде . 7 табл. i (Л оо сд со ю to

2 А1

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)4 С 05 F 11 08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3939752/31-13 (22) 26.07.85 (46) 15.12.87. Бюл. ¹- 46 (71) Институт генетики и цитологии

АН БССР (72) Н.А. Троицкий, M.À.. Новицкая, Т.M. Троицкая и В.M. Васильев (53) 576.8(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 11331166118899, кл. С 05 F 11/08,24.04.85. (54) IIITAMM AZOTOBACTER CHROOCOCCUM

ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕ-, НИЯ ПОД ТОМАТЫ (57) Изобретение относится к микробиологической промьппленности. Оно представляет собой штамм несимбиотического азот-фиксатора Azotobacter

chroococcum ЦМПМ В-3344, способный специфически прикрепляться к корням томатов и вступать с томатами в ассоциативный симбиоз. Бактериальное удобрение с торфяным наполнителем, полученное на основе этого штамма, повышает урожай томатов на 29Х и обладает долговременным действием.

Штамм характеризуется повьппенной вы- Сй (O живаемостью клеток в торфяной среде. 7 табл.

13592

Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой штамм Azotobacter chroococcum для получения бактериально5 го удобрения под томаты.

Целью изобретения является полу.чение нового штамма Azotobacter

chroococcum для производства бактериального удобрения, специфически по- 10 вышающего урожай томатов.

Штамм получен путем селекции одновременно на комплекс положительных признаков — сродство (способность прочно прикрепляться) к поверхности корней томатов, размножение на корнях в присутствии определенной почвы, конкурентоспособность с ее естественной микрофлорой. Методика селекции заключалась в многоступенча- 20 том отборе клеток азотобактера, прочно связанных с поверхностью корней томатов после длительного выращивания обработанных большим количеством клеток исходного штамма азотобактера 25 проростков томатов в нестерильной почве. Для исключения случаев отбора природных клеток азотобактера (как это случалось при использовании известных методов селекции) в исходную культуру клеток вводилась генетичес.кая метка. Клоны, отобранные с поверхности корней и способные при последующей обработке колонизировать корневую систему (показывать сплошное обрастание корней), отличались от исходного штамма-прототипа наличием и повышенным синтезом определенных экзобелков, обнаруживаемых при гель-эктрофорезе. 40

Специализированный штамм селекционировался затем на способность размножаться в торфяной среде — субстрате для получения бактериального удобрения.

Полученный штамм назван авторами

Azotobacter chroococcum Т-12 и депонирован в Центральном Музее промьппленных микроорганизмов ВНИИгенетики под ¹ В-3344.

Штамм Azotobacter chroococcum

ЦМПМ В-3344 имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические особенности штамма. Крупная короткая

55 палочка с закругленными концами, имеются жгутики, протоплазма у молодых клекток гомогенная и блестящая.

Клетка одета капсулой. Покоящаяся

Состав питательной среды для культивирования штамма в ферментере приведен в табл. 1.

Таблица 1

Расход на 30-литровый ферментер, r

Концентрация, г/л

Компоненты

195,0

10, 00

0,64

Сахар пищевой

K НР0

КН РО

MgSO, 12,5

0,16

3,1

0,20

3,9

NaC1

0,20

3,9

1,0

CaS04 2 Н О

Ма МоО, FeSO

0,05

0,001

0,003

0,002

0,006

Дрожжевой экстракт

0,5

9,8

Пеногаситель (олеиновая к-та) 1,95

0,1

72 2 форма — циста. Молодая культура бесцветна, старая — коричневая.

Продукт, синтезируемый штаммом.

Гетероауксин„ витамины группы В, гиббереллины, фиксирует молекулярный азот.

Аэотфиксирующая активность определяется ацетиленовым методом на хроматографе.

Способ, условия и состав среды для хранения штамма. На косяках агаризованной среды Burk под минеральным маслом при 5 С 1 год. Состав среды Burk на 1 л: К НР04 0,64, г;

КН РО 0,16 г; MgSO< 0,2 г; NaC1

0,2 г; CaSO4 2HzO 0,05 г; NazMo04

1 мг; FeSO< 3 мг; сахароза 20 r.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма. Поверхность агаризованной среды Burk, t=28 С.

Условия и состав сред для ферментации. Аэрация. !

13592

2 3

Вода водопроводная, л

19,5

Таблица 2

Влияние бактериального удобрения на основе штамма Azotobacter сЬгоососситп ЦМПМ В-3344 на томаты.

Дата начала цветения

Средний вес Урожай, одноro пло- кг/м

Опыт

Толщина стебля, мм

Содержание витамина С мг/100 г сырого веса да, г

1/XI

2,4. 26,4+ 1,1

3,1 30,2+ 1,6

80-90

80-110

Контроль

23/Х

Опыт

Прибавка, X

14

20 рН 6,8-7,0 доводится 20Х-ным раст- 10 вором NaOH или разбавленной НС1

Свойство штамма Azotobacter chroo- 15 соссшп ЦМПМ В-3344 — прикрепляться к корням томатов и в результате этого повышать их урожай стабильно.

Стабильность штамма проверялась путем испытания его в производствен- 2р ных условиях. Штамм, прошедший более

70 пересевов на агаризованную среду

Бэрка и 5 месячное культивирование в торфе, был внесен под культуру томата сорта Русич. Через 117 дней после 25 бактеризации сеянцев томатов их корТехнология заводского приготовления препарата.

Штамм ЦМПМ В-3344 выращивают в ферментере на модифицированной среде Бэрка (состав среды приведен в Б0 табл. 3) с аэрацией до концентрации ч

10 кл/мл и культуральную жидкость инокулируют в полиэтиленовые пакеты с простерилизованным гамма-лучами в

4 дозе 2 ° 10 г измельченным торфом. Соотношение массы инокулята и торфа

1:3. После доращивания в термостате (при 28 С) в течение 3 сут удобрение готово к использованию.

72 4 ни были извлечены из почвы, отмыты от нее и разложены на поверхности агариэованной среды Бэрка. Через

48 ч корни были по всей длине покрыты колониями штамма ЦМЛМ В-3344. Прибавка урожая в опыте составила

37,27. Средний вес одного зрелого плода в контроле 54,75 г, в опыте

70,06 г.

Пример. Штамм размножают на агаризованной среде Бэрка, вносят в почву теплицы с добавлением в нее мела 5 г/кг, К<НРО4 0,4 г/кг, этилового спирта 6 мл/кг и подращивают

2 сут при 30 С в герметичных полиэтиленовых мешках (по 0,5 кг препарата в каждом), наполненных воздухом.

Количество азотобактера в 1 r препарата 10 -10 клеток,. Препарат внов сят в корневую систему растений томата при высадке.их в грунт теплицы.

Контролем служат растения, не.обработанные препаратом.

Сравнительные данные приведены в табл. 2.

Известные штаммы Azotobacter

chroococcum не живут на поверхности корней и не формируют симбиотических ассоциаций с растениями. Их полезное действие проявляется, например, на томатах в кратковременной ростостимуляции, что ведет к повышению урожаев лишь при первых сборах плодов.

Колонизация корней томата поСле инокуляции почвы штамм-прототипом К и штаммом ЦМПМ В-3344 исследовалась методом обрастания. Через 18 дней после инокуляции корни томатов отмывали от почвы, взвешивали и рас135927

Т а блица 4

Расход 15 на 30-литровый ферментер, г

Концентрация, г/л

Компоненты

195,0 20

Штамм

10,00

Сахар пищевой

Биомасса надземной части томата, %

Био0,64 масса корней, %

12,5

К НРО

КН РО

М@БО, 0,16

3,1 почва песок песок

3,9

0,20

0,20

3,9

NaC1

К(прототип) (контрольный) CaSO4 2Н О

NazMoO, Ре SOq

1,0 30

0,002

0,05

100

100

100

0,001

0,003

ЦМПМ В-3344 (опыт) 120,7 128

179

0,006

I

Дрожжевой экстракт

9,8

0,5

Пеногаситель (олеиновая к-та) 0,1

1,95

Вода водопроводная, л

19,5 кладывали на поверхность агаризованной среды Бэрка. Через 3 сут определяли обрастание корней. B контроле после обработки штаммом К-прототипом

5 обнаружена одна колония штамма-прототипа на 1 r корней. В опыте пос ле обработки предлагаеМым штаммом наблюдали сплошное обрастание корней клетками этого штамма. 10

Таблица 3

Состав модифицированной среды

Бэрка рН 6,8-7,0 доводится 20%-ным раствором NaOH или разбавленной НС1

Сравнительное исследование влияния обработки культуры томата клетка50 ми прототипа (штамма К) и штамма

ЦМПМ В-3344 на рост биомассы томата.

Корни рассады томата при пикировке обмакивают в звесь с одинаковой концентрацией клеток штамма К (контроль)

55 и специализированного штамма (опыт) и высаживают в почву. Через 18 дней

2 6 вегетации определяют массу надземной части растений. Масса в опыте превысила массу в контроле на 20,7%. При высадке рассады томата после обработки бактериями в песок, преимущества в действии специализированного штамма над штаммом-прототипом еще более значительны: масса надземной части растений увеличивается на 28%, а масса. корней на 79%. Эти данные сведены в табл. 4.

Влияние суспензии клеток Azotobacter chpoococcum на прирост биомассы томатов.

При исследовании корневой системы растений в опыте обнаружено сплошное обрастание поверхности корней клетками штамма ЦМПМ В-3344, в то время как в контроле наблюдались лишь единичные колонии штамма К.

Штамм увеличивает продолжительность полезного действия бактериального удобрения за счет большего времени функционирования в корневой системе. Исследование кинетики прибавки урожая томатов в производственных условиях показало, что после обработки рассады прибавка сохраняется на протяжении всех 11 сборов в течение

1,5 мес, в то же время при обработке природными штаммами, в том числе штаммом К, прибавка урожая наблюдается только в первых сборах.

Это показано в табл. 5 и 6.

1359272

Таблица 5

Результаты производственных испытаний влияния обработки корней рассады томатов сорта Реанте бактериальным удобрением на основе штамма ЦМПМ В-3344 на урожай.

Урожай томатов по месяцам, кг

Опыт май июнь июль тябрь всего

Контрольный участок (250 мг) 186 587 461

1761

191

336

Обработка удобрением (250 м ) 406 267 701

549 223

2146

21,8

19,1 16,7

20,8 43,5 20,4

Прибавка урожая, Х

Таблица 6

Динамика сбора плодов томатов в грунтовой таблице после обработки рассады бактериальным удобрением на основе штамма ЦМПМ В-3344 в сравнении с прототипом, 1984-1985 гг.

Действующее начало Сбор плодов по месяцам, кг/м удобрения декабрь январь февраль март апрель всего

0,4

0,7 0,71

Штамм К

0,73 0,4 2,94

Штамм ЦМПМ

В-3344

0,8 0,95

14 34

0,6

0,8 0,62 3,77

9 55 28

Разница, Х

Как видно из таблицы, применение удобрения на торфяной основе дало прибавку урожая в 1,5 кг плодов с каждого м опытной делянки, или в среднем на 21,8Х.

Как видно из таблицы, прибавка урожая по сравнению с прототипом сохранилась на протяжении всего периода сбора урожая.

Преимущество штамма Azotobacter

chroococcum В-3344 над К (этого же вида) особенно четко проявляется при изменении почвенных условий. Так, попытка применения штамма К для повышения урожая томатов в грунтовой теплице ИФ и БР AH Таджикской ССР оказалась безуспешной, тогда как

4б применение варианта специализированного штамма ЦМПМ В-3344, селекционированного для культуры томата сорта

Юрмалас, выращенного в данной почве, повысило урожай этого сорта томата на 40,9Х на опытной площади

1000 м и урожай сорта Майкопский урожайный на 29Х на площади 5000 м .

Это преимущество штамма ЦМПМ

В-3344 объясняется его приживаемостью в данной почве и ингибирующим действием почвы на штамм К. Вывод иллюстрируется опытом: в стерильную вытяжку из почвы грунтовой теплицы

ИФ и БР АН Таджикской CCP вносят

1359272

Таблица 7

Влияние обработки семян томата штаммами ЦМПМ В-3344, Т9 и К на урожай биомассы проростков.

Штаммы

Показатель

Т9 ЦМПИ К

В-3344

Биомасса надземной части на 1 растение, r 00, . 112 2 О0, . 117 7 О0, 11

По отношению

4о к штамму Т9, 100 142

Формула иэ обретения

1 Штамм Azotobacter chroococcum

ЦМПМ ВНИИ-генетика В-3344 для полур чения бактериальнога удобрения под томаты.

Составитель Л. Борисова

Редактор Н. Горват Техред М.Моргентал Корректор А. Ильин

Заказ 6111/24 Тираж 408 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 суспензию клеток варианта штамма

ЦМПМ В-3344 (опыт) и штамма К (конт троль) в концентрации 10 кл/мл, инкубируют при 28 С 4 сут с ежеднев5 ным измерением концентрации клеток во взвеси. В опыте во взвеси через

2 сут обнаружено 10 кл/мл штамма в

ЦМПМ В-3344. Роста культуры в контроле не наблюдается даже через 4 сут. 10

Использование предлагаемого специализированного штамма позволило получить торфяное удобрение с большим по сравнению с прототипом (порядка 10 кл/г) титром жизнеспособных 15

9 клеток и дольшей стабильностью при хранении.

Способность клеток штаммов расти и сохраняться в торфяной среде (торфяной порошок с добавлением извести 20 до pH=7 и компонентов питания вместе с культуральной жидкостью при инокуляции) исследовалась по сравнению с известным штаммом. С этой целью двухнедельную агаровую культуру штамма К смешивали со стерильным торфом, содержащим компоненты питательной среды, до начальной концентрации

10 кл/мл и хранили 2 мес при комнатной температуре, периодически опре- 30 деляя титр (количество) жизнеспособ, ных клеток. Через 8 дней титр упал на 2 порядка, через следующие

10 дней — еще в 120 раз. Через 2 мес инкубации жизнеспособные клетки не обнаруживались. Торфяной препарат специализированного штамма ЦМПМ

В-3344 готовили путем инъекции культуральной жидкости в концентрации

10 кл/мл в торфяную среду в соотношении торф: культуральная жидкость, равном 3:1, Через 2 сут хранения при комнатной температуре в препара7 те обнаружено 5,4 10 кл/г, еще через сутки - 5,6 10 кл/г. Следовательно, штамм ЦМПМ В-3344 обладает способностью к доращиванию на торфяной среде. Через 2 мес хранения тит составил порядка 10 кл/г торфяной среды. Таким образом, сохранность клеток специализированного штамма в торфяном удобрении выше, чем клеток штамма-прототипа.

Предложенный штамм специфически повышает урожай томатов. Штаммы, специфичные к другим растениям, например штамм Т-9, специфичный к ячменю, не оказывают такого эффекта, 1

Пример.Семена томатов сорта

Русич замачивали в суспензии торфяных препаратов штаммов IJMllM В-3344, Т9 и К с равной концентрацией жизнеспособных клеток, высевали в грунт и помещали под светоустановку. Через 25 сут взвешивали надземную часть растений.

Опыт проводили двукратно: в трех повторностях по 10 семян в каждом варианте. Средние результаты приведены в табл. 7.