Способ получения изоформ миозина

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии и касается исследований структуры и строения миозинов различного функционального назначения, что может найти применение в медицинской диагностике . Сущность способа состоит в следующем. Образцы миозина растворяют в 0,1 М трис-глициновом буфере, содержащем пирофосфат натрия (0,08- 0,09 М), этилендиаминтетраацетат

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 G О1 N 27/26. А 61 К 37/02

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ -с.т Л .

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНф

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4103070/31-13 (22) 25.07.86 (46) 15,01,88. Бюл. М - 2 (71) Ленинградский государственный университет им. А. А. Жданова (72) Т. Н, Прияткина, Т. А. Гойло и О. P Зарембская (53) 663.15(088.8) (56) Febs Lefters, v. 29, 1973, р. 292-296.

Biochemestry, v ° 14, 1975, !1 - 4, р. 742-747. (54) .СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОФОРМ МНОЗИНА (57) Изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии и касается исследований структуры и строения миозинов различного функ„„SU„„1366930 A 1 ционального назначения, что может найти применение в медицинской диагностике. Сущность способа состоит в следующем. Образцы миозина растворяют в 0,1 М трис"глициновом буфере, содержащем пирофосфат натрия (0,080,09 M), этилендиаминтетраацетат (0,001 М) и меркаптоэтанол (1-2X) до конечной концентрации 500-800 мкг/мл.

Электрофорез ведут в полиакриламидном геле, приготовленном на том же буфере, что и образец, причем концентрацию акриламида выбирают 4Ж, а соотношение акриламида и бис-акриламида 40:1-50:1, и в качестве электродного буфера используют 0,050,07 М трис-глицин, содержащий аденозинтрифосфорную кислоту.

1366930

Изобретение относится к молекулярной биологии и биохимии, а именно к исследованиям структуры и строения миозинов различного функционального назначения, и может быть использовано в медицинской диагностике.

Целью изобретения является упрощение и ускорение процесса получения изоформ миозина, 10

Способ осщуествляют следующим образом.

Растворение образца миозина проводят в 0,1 M трис-глициновом буфере, содержащем 0,08-0,09 M пирофосфата 1 натрия, 0,001 M этилендиаминтетраацетата и 1-2Х меркаптоэтанола. Электрофорез ведут в полиакриламидном геле, приготовленном на том же буфере, что и образец, причем концентрацию 2р акриламида выбирают 4Х а соотношение акриламида и бис-акриламида 40:150:1. В качестве электродного буфера используют 0,05-0,07 М трис-глицин, содержащий аденозинтрифосфорную кислоту. Использование данной совокупности признаков позволяет получать

1 препаративные количества (1-2 мг в одном цикле электрофореза) изоформ миозина наиболее дешевым способом с 30 использованием стандартной электрофоретической аппаратуры в трубках или пластинах полиакриламидного геля.

Пример 1. Осадок, содержащий 5 мг высокоочищенного миозина из скелетных мышц кролика, экстрагировали 1 ч при 4 С 1 мл 0,1 М трис-глицинового буфера рН 8,9, содержащего

0,09 М пирофосфата натрия, 1-2% меркаптоэтанола и 0,001 M этилена- амин- 10 тетрацетата. Нерастворимый материал удаляли центрифугированием при

20000g в течение 30 мин. Концентра" ция миозина в растворе составляла около 800 мкг/мл. К раствору миозина добавляли 10% сахарозы. Готовили полиакриламидный гель (4% акриламида и 0,1% бис"акриламида) на 0,1 М трис" глициновом буфере рН 8,9, содержащем

0,09 M пирофосфата натрия, 0,001 M . этилендиаминтетраацетата, который полимериэовали в стеклянных трубках (5 мм х 80 мм) с использованием катализаторов ТЕМЕДа (0,4%) и персульфа та аммония (О, 2X) . В каждую трубку вносили 200 мкл белкового образца (160 мкг миозина), настаивали свер" ху 0,2-0,3 мл 0,1 M трис-глицинового буфера, содержащего 0,09 M пирофосфата натрия и 10Х глицерина. В качестве катодного буфера (верхняя камера) использовали 0,07 M трис-глицин рН 8,5, содержащий 0,005 M аденозинтрифосфорной кислоты, в качестве анодного буфера (нижняя камера) использовали 0,05 М трис-глицин рН 8,5, Электрофорез вели в стандартных аппаратах фирмы "Reanal" (Венгрия), включающих 12 трубок, при 4 С, наО: пряжении 10 В на см в течение 24 ч.

После электрофореза гели окрашивали на белок или АТФазную активность стандартными методами.

Пример 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но растворение миозина проводили в 0,1 М трисглициновом буфере рН 8,3, содержащем

0,08 М пирофосфата натрия, 1-2% меркаптоэтанола и 0,001 M этилендиаминтетраацетата. Концентрация миозина в растворе около 500 мкг/мл.

Пример 3. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но готовили полиакриламидный гель, содержащий

4% акриламида и 0,08% бис-акриламида.

П р и м .е р 4, Способ осуществляли аналогично примеру 1, но в качестве электродного буфера использовали 0,05 М трис-глициновый буфер рН 8,5, соДержащий 0,005 М аденозинтрифосфорной кислоты, Пример 5. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но полиакриламидный гель полимеризовали в стеклянных камерах (1,5 мм х 80 мм х х 140 мм), Формула изобретения

Способ получения изоформ миозина, предусматривающий приготовление образца миозина, разделение его путем проведения электрофореза в полиакриламидном геле в электродном трис-глициновом буфере, содержащем аденозинтрифосфорную кислоту, о т л и ч а— ю шийся тем, что, с целью упро" щения и ускорения способа, приготовление образца миозина проводят в

О,1 М трис-глициновом буфере, содержащем 0,08"0,09 М пирофосфата натрия, 0,001 М этилендиаминтетраацетата, 1-2Х меркаптоэтанола, при этом электрофореэ проводят в 4%-ном полиакрил" амидном геле, приготовленном на том же буфере, при соотношении акриламида и бис-акриламида 40:1-50:1, а используемый электродный буфер содержит 0,05-0,07 М трис-глицина.