Способ определения l-аминокислот

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

Ai (19) (11) (su 4 G 01 N 27 46 С 12 P 13/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А8ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Egg,у, (21) 4120397/31-13 (22) 02.07,86 (46) 07 ° 04.88. Бюл. Ф 13 (71) Институт биохимии AH ЛитССР (72) Ю. Ю. Кулис, M. В. Песлякене и .В.-С.А. Лауринавичюс (53) 663.15(088.8) (56) White W. G., Guilbault G. G.

Lysine specific enzyme electrode

for determination of Lysine in

Grains and Foodstuffs. — Anal. Chem, 1978, v. 50, р. 1481-14, Ianiello R. М., Jacyn" h А. M.

Immobilized Enzyme Chemically Modified Electrode as an Ampегоmetri e

Sensor. - Anal Chem, l98l v. 53, р. 2090-2095, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ (57) Изобретение касается исследования и анализа материалов путем определения тока и может быть исполь" зовано для определения L-аминокислот. Цель изобретения - упрощение процесса и повышение селективности определения Ь-аминокислот. Для этого в иммобилиэованную мембрану окси" дазы L-аминокислот вводят пероксидазу, электролиз проводят в слабощелочном буферном растворе в присутствии ферроцианида калия в концентрации 1-2 м1(.при ОВ на графитном электроде беэ предварительной его модификации химическим путем относительно Ag/AgC1 электрода сравнения и концентрацию L-аминокислот определяют по увеличению катодного тока.

1 ил., 5 табл.

1386883

Изобретение относится к электро" химическим методам анализа материа" лов, а именно к способу количествен" ного определения L"àìèíîêèñëîò путем измерения тока при электролизе во время ферментативных реакций, Целью изобретения является упрощение процесса и повышение селективности определения L-аминокислот, (На чертеже показана схема измерительной ячейки для осуществления способа.

Способ включает электролиз иссле" дуемого вещества в слабощелочном фосфатном буфере с использованием графитного электрода, покрытого мембраной иммобилиэованной оксидазы

4H 0 +)Fe(CN) ) +2Н перок

Количество добавляемой в мембрану пероксидазы должно быть такий, что" бы реакция, катализуемая перок" сидазой по уравнению (1), была быстрой, т.е. не лимитировала общий процесс. Для этого достаточен 1050-кратный избыток пероксидазы по сравнению с оксидазой L-аминокислот по активности. Выход за верхний предел не требуется и нецелесообразен экономически. Кроме того, при увеличении концентрации фермента увеличивается толщина мембраны, в результате увеличивается ответ электрода и уменьшается его чувствительность, Восстановление образующегося ферроцианида на графитовом электроде при О В приводит к генерации катодного тока, величина которого пропорциональна концентрации L-аминокислоты.

Предлагаемый способ не требует химической модификации графитного электрода, таким образом упрощается процесс. Повьппение селективности обеспечивается тем, что электролиэ проводится при О В, а при этом потенциале основные электрохимически активные вещества не окисляются и величины фоновых токов при введении проб реальных образцов не превьппают 17.. Поэтому концентрации L"àìèнокислот в реальных средах опре" деляют по калибровочному графику для чистого. раствора.

Измерительная ячейка состоит из корпуса I изготовленного из орга"

10

L-аминокислот, и электрода сравнения из Ag/AgC1 и измерение тока в ячейке при взаимодействии фермента с суб" стратом, перед электролизом в буферный раствор вводят ферроцианид калия в концентрации 1"2 мМ, в иммобилнзованную мембрану оксидазы L-аминокислот дополнительно вводят пероксидазу, а графитный электрод используют без химической модификации, электролиз проводят при О В и концентрацию Ь"аминокислот определяют по увеличению катодного тока.

В ферментной мембране, содержащей оксидазу Ь-аминокислот и пероксидазу, кроме окисления L-аминокис" лоты, происходит превращение по схеме сидаза 21Ре(СН),) +2Н О. (1) нического стекла и содержащего вход" ной и выходной патрубки для промыв" ки и заполнения ячейки буферным раствором, и измерительной камеры

2 с магнитной мешалкой 3, в которую помещены рабочий графитный электрод

4, покрытый иммобилизованной мем" браной 5 и электрод 6 сравнения из

30 Ag/AgC1 и которая содержит верхнее отверстие для введения пробы. Промывка и заполнение измерительной камеры буферным раствором осуществляют при помощи двухканального

35 перистальтического насос а, Рабочий и вспомогательный электроды присоединены к полярографу с самописцем.

В измерительную ячейку объемом

1 мл, содержащую буферный раствор с

40 ферроцианидом калия, вводят 0,05 мл раствора L-аминокислоты. При взаимо.действии фермента с субстратом измеряются параметры ячейки. После анализа ячейка промывается 1,5 мин стру45 ей буфера, после чего можно проводить следующее измерение.

Пример 1. Определение концентрации Ь-лейцина.

Для приготовления ферйентной мембраны 3 мг оксидазы L-аминокислот, 10 мг пероксидазы и 16 мг сывороточного альбумина растворяют в 0,2 мл

0,01 М фосфатного буферного раствора рН 7,5, 0,1 М КС1. Смесь обрабатыва55 ется 5 мкл 5Х- íîãî глутарового альдегида и выливается на диализную

1 мембрану площадью б см . Высушенная при 4 С мембрана, толщина которой

50 мкм, надевается. прямо на графит1386883

Из табл. 3 видно, что ток ячейки зависит от концентрации ферроцианида калия в буферном растворе.

При увеличении концентрации медиатора до 1 мМ ток увеличивается, а при концентрации соединения выше

1 мМ практически не меняется. Таким образом, способ реализуем при концентрации медиатора выше 1 мМ, а с

55 ный электрод и прикрепляется резиновым кольцом.

Определение L-лейцина при помощи приготовленного ферментного электрода проводят в 0,01 M фосфатном бу5 фере рН 7,5, содержащем 0,1 М КС1 и 2 мМ ферроцианида калия, потенциал графитного электрода 0,0 В относительно Ag/AgC1 электрода.

Данные изменения катодного тока при изменении концентрации добавленного Ь-лейцина приведены в табл. 1.

Из табл. 1 видно, что прямолинейность калибровочного графика наблюдается до 0,8 мМ ?.-лейцина.

Пример 2, Определение концентрации различных аминокислот.

Ферментная мембрана и ферментный электрод изготавливаются аналогично примеру 1. Определяется ток в буферном растворе, содержащем разные аминокислоты: 0,01 М фосфатный буфер рН 8,0, 0,1 M КС1, концентрация ферроцианида калия 1,5 мМ, концентрация аминокислот 0,5 мМ. Условия определения, как в примере 1.

Результаты представлены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что наилучшим субстратом для оксидазы L-аминокис30 лот является 1-лейцин, однако можно определять и L-метионин, L-Я-фенилаланин, Ь-триптофан, L èзолейцин, Ь-аргинин. D-Аминокислоты, L-алании, L"àñïàðàãèí, L-треонин и L-пролин практически не мешают определению.

Пример 3. Определение зависимости тока ячейки от концентрации ферроцианида калия и рН буферного раствора.

Каталитическая мембрана и ферментный электрод изготовлены, как в примере 1, Определяется концентрация

L-лейцина в зависимости от концентра" ции ферроцианида калия в фуберном

45 растворе рН 7, 8, концентрация L-лейцина 1,0 мМ, Условия определения, как в примере 1, Данные приведены з табл. 3. целью экономии реагента оптимальная концентрация 1 мМ.

Показания электрода зависят от рН буферного раствора. Так, при наличии в ячейке 0,6 мМ L-лейцина при рН 6 0 ток ячейки 390 нА, при рН

6,5 — 450 нА, при рН 70 — 485 нА, при рН 7,5 - 480 нА, при рН 8,0

482 нА, при рН 8,5 - 465 нА, при рН 9,0 - 436 нА, Таким образом, интервал рН 7-8 является оптимальным.

Пример 4. Определение концентрации L-лейцина в средах выращивания микроорганизмов.

Каталитическая мембрана изготовлена, как в примере 1. Среды для выращивания микроорганизмов приготовлены путем растворения соответствующих количеств Ь-лейцина в культуральных средах. Измерения проводятся, как для чистых растворов, концентрация L-лейцина определяется по калибровочному графику для чистых растворов, Условия определения, как в примере 1.

Данные измерений представлены в табл. 4, Из табл. 4 видно, что точность определения (т.е. коэффициент вариации) не превышает ЗЖ. Остаточный ток в средах не превышает 0,5-1,07, так как вещества, находящиеся в реальных растворах, являются электрохимически неактивными при нулевом потенциале графитного электрода.

Пример 5, Определение стабильности электрода во времени.

Ферментный электрод изготовлен, как в примере 1. Концентрация Ь-лейцина 0,5 мМ. Условия определения, как в примере 2.

Результаты зависимости тока от продолжительности сохранения электрода представлены в табл. 5, Из табл. 5 видно, что работоспособность электрода сохраняется в течение 2 мес.

По сравнению.с известным предлагаемый способ определения L-аминокислот является более простым, экспрессивным и селективным, так как отсутствуют операции предварительной обработки образцов, химической модификации электрода и определения влияния других веществ, которые на" ходятся в биологических реальных средах. Быстрота анализа особенно важна в микробиологической промыш1386883 ленности при непрерывном контроле уровня L -аминокислот.

Таблица 1

Концентрация 0,12 0,24 0,36 0,48 0,60 0 80 1,0 1,5

Ь-лейцина, мМ.Ою 107 Ов220 Оэ326 Оэ432 Оэ538 Ою 700 Оь 830 0 ° 905

Ток, мкА

Таблица 2

Продолжение табл.2

31,4

L- Ги ст иди н! ! ( (L-Лейцин (16,1

L-Глутамин

30!

5,0

L-Валин

100

1,7

L-Алании

94,1

Ь-Метионин!

L-)3-Фенилаланин

L-Аспарагин

83,9 с1

Ь-Треонин

L-Триптофан

57,6

L-Пролин

54,2

Ь-Изолейцин

D-Аминокислоты

49,2

L-Аргинин

Таблица 3

l 0 1,5 2,5 5,0 10,0

О ° 21 0 36 0 55 О бб Оэ73 О ° 80 Оэ82 Оэ80 Ов81 Оэ81

Ток, мкА

Формула изобретения

Способ определения L-аминокислот, включающий электролиз исследуемого вещества в буферном растворе с использованием графитового электродапокрытого мембраной иммобилизованной оксидазы L-аминокислот, и электрода сравнения из Ag/AgC1 с послеl

Концентрация ферроцианида О,1 0,2 0,4 0,6 калия, мМ дующим определением концентрации

Ь-аминокислот по увеличению тока, отличающийся тем,что, 5 с целью упрощения процесса и повыщения селективности, перед электролизом в буферный раствор вводят ферроцианид калия в концентрации 1-2 мМ, в иммобилизованную мембрану оксидазы

L"àìèíoêèñëoò дополнительно вводят пероксидазу, при этом электролиз ве" дут при нулевом потенциале относительно электрода сравнения.

1386883

Таблица 4

Концентрация Ь-лейцина, мМ

Среда

Основные компоненты

Найдено

Взято

О ю 251+0 в008

0 505+0,018

0,750+0,026

0,250 0,006

0 495 0 012

0,745 0,20

0,25

Среда для выращи» КН РО (NH ) вания дРожжей $0 в М8$04 глюкоза, вода

0 50

0,75 к НР04 кс

NaNO» Fe$Oy, мальтоэа, глю" коза, дрожжевой экстракт

0,25

Среда для выращивания В. subtilis

0,50

0,75

0,25 0,249+0,006

К,НРО КЮ„

NaCl, глюкоза, мочевина

Среда для выра" щивания Pseudomonas

0 501 0 010

0 752 0 023

0 50

0,75

)ТбблвЦб S йолмчбетео албц абцСУЗИВ ЗЛбб"

ТфКЩб

30 32 33 42 47 SO 52

8!8 19 29

Тек, ей 464 480 472 410 36S

l 386883

Составитель В. Варламов

Техред Л. Олийнык Корректор М. Шароши

Редактор О. Юрковецкая

Заказ l490/42 Тираж. 847 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

313035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4