Способ получения негамицина

 

". -а > ? л т тех 1; лч иск, ю

ИСАНИЕ

Союз Советскик

Социалистических

Республик

О П (11) 622414

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К IlkTEHTV (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено08.05.70 (21) 1435767/28-13 (23) Приоритет (32) 08.05.69 (31) 34827/69 (33) Япония

2. (51) М. Кл.

С 12 Q 9/14

Государственный комитет

Совета 1йиннстроа СССР оо делам изооретеннй н открытий (53) УДК 615.45с

:615.779.931 (088.8) . (43) Опубликовано30,08.78,Бюллетень № 32 (46) Дата опубликования описания 24.07.78

Иностранцы

Хамао Умеэава, Кендэи Маеда, Синичи Кондо, Томно Такеучи .и Маса Хамада (Япония) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Дэайдан Ходэин Бисейбутсу Кагаку Кенкю Кай (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕГАМИЦИНА

Изобретение относится к производству анти бн отик ов.

Предлагаемый способ получения негамиинна ранее в патентной и научно-технической литературе ие описан и заключается в том, что штаммЯ ефоттт сее, puv peOf0SÑ0s АТСС 21470 выращивают в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением . антибиотика.

Штамм Я ефоттт сее рп рео1нвсць

АТСС 21470 выделен иэ образиа почвы, 1а собранного в Миогизане, префектура Гунма, хранится в Американской коллекиии типовых культур под номером АТСС

21470 и- характеризуется следующими культурально-морфологическими и фиэиоло- ро го-биохимическими свойствами.

Культурально-морфологические признаки. Штамм образует хорошо разветвленный субстратный мииелий под прямым направлением к гибкому аэривльному мицелию без 25 разветвления завитков и образования спиралей. Поверхность спор гладкая, Глииерин Чапека с агаром. При инкуо банни при 27 С культура цветом от светло-желтого до темно-желтовато-коричневого образует обильный мииелий светло/ серого цвета, растворимый пигмент цветом от коричневого до бледно-красновато-коричневого.

Среда Краинского с глюкозой, аспврагином и агаром. Культура от желтоватокоричневого до темно-желтовато-коричневого цвета, образует мииелий цветом or желтовато-белого до светло-коричневатосерого„- растворимый пигмент имеет слабый коричневый ивет.

Среда с мвлевтом кальция и агаром.

Культура серовато-коричневого ивета о6 разует скудный мниелнй цветом от серовато-белого до светло-серого, растворимый пигмент не образует.

Пептоновый раствор, содержащий 1,0% нитрата натрия, Культура от бесиветной до светло-желтовато-коричневого цвета

622414 без аэриального мицелия, растворимый пигмент отсутствует или наблюдается небольшое количество коричневого пигмента; слабое восстановление нитрата.

Картофельная среда. Морщинистая куль тура цветом от светло-желтовато-коричне- 5 ного до желтовато-коричневого, позднее до темно-желтовато-коричневого и до чер ного, отсутствует аэриальный мицелий, растворимый пигмент слабо-коричневого цвета. о

Пластинка иэ крахмала с агаром. Куль тура цветом от светло-желтовато-коричневого до желтовато-коричневого, образует аэриальный мицелий цветом от желтоватобелого до светло-серого, растворимый пигмент цветом от коричневатого до светло-KpscHoBRT o-коричневого.

Питательная среда с агаром. После инкубации при 37 С в течение 14-ти суток роста культуры не наблюдается. Посо ле инкубации при 27 С культура светлокрасновато-коричневого цвета, не образует аэриального t мицелия и образуетсветло-красновато- коричневатый растворимый пигмент. 25

Среда Лоффлера с коагулированной сыо вороткой. После инкубации при 37 С в течение 14-ти суток роста культуры не наблюдается.

Желатиновая среда, После инкубации о при 20 С культура от бесцветной до свет» ло-желтовато- коричневой, не образует аэриального мицелия и образует растворимый пигмент цветом от коричневого дб темно-коричневого. 35 о

Снятое молоко. После инкубации при

37 С бесцветная культура не образует аэриального мицелия или растворимого nur-.

MeHT&

Среда с тирозином и агаром. После 40 о инкубации при 27 С культура от бесцвет- ной до серого или темно-коричневого цвета, образует тонкий аэриальный мицелий цветом от белого др серовато-белого.

Физиолого-биохимические признаки. .

Аэроб. Оптимум роста при 27 С.

Гидролизует крахмал, Разжижает желатину.

Пептониэирует молоко.

Отношение к углеводам. Усваивает глюкозу, сахароэу, мальтозу, маннозу, галактозу, глицерин, декстрин, крахмал.

Не усваивает фруктозу, ксилоэу, инозит, лактозу, раффинозу, рамнозу, инсулин, сорбит, арабинозу, салицин, дульпит.

Антагонистические свойства. Ингибирует рост РЕЕидоптоиаб,ба2итоиеИа, М еЪа еПа,Ыар у2ососсцв,Р о1ещ.

Конкретные примеры осуществления предлагаемого способа приведены ниже.

Пример 1. 125 мл среды состав&,%;

Глюк рза 2,0000

Крахмал 2,0000

Соевая мука 2,0000

Экстракт дрожжей 0,5000

Хлористый натрий 0,2500

Карбонат кальция 0,3500

Пентагидрат сульфата меди 0,0005

Гептагидрат хлористого марганца 0,0005

Гептагидрат сульфата цинка 0,0005 помещают в колбу емкостью 500 мл. Устанавливают рН 7,0 и стерилиэуют смесь о при 120 С в течение 20 мин. Затем в асептических условиях к этой среде прибавляют 2,5 мл 2-дневного бульона штамма АТСС 21470, Среда для затравочной культуры содержит, %:

Глюкоза 1,0000

Крахмал 1,0000

Мясной экстракт 0,7500

Пелтон 0,7500

Хлористый натрий 0,3000

Гептагидрат сульфата магния 0,1000

Пентагидрат сульфата меди 0,0007

Гептагидрат сульфата двух валентного железа 0,0001

Гептагидрат хлорида марганца 0,0008

Гептагидрат сульфата цинка 0 0002, Сбраживание ведут 5 суток при 27 С и при встряхивании со скоростью 130 колебаний в минуту Этот бульон центрифуги-. руют для отделения мицепия, и 600 мл фильтрата получают из шестидесяти склянок. Фильтрат содержит >35 мкгlмл негамицина. Фильтрат пропускают через колонку (диаметр 30 см) с 400 мл амберлита 11 С-50 (70%-ная натриевая форма), После промывания водой негамицин элюируют 20%-ным водным аммиаком. Активную фракцию обьемом 600 мл концентрируют при пониженном давлении и. получают 144 мл концентрированного раствора (рН 9,4 800 мкг/мл).

Концентрированный раствор пропускают через колонку (диаметр 16 мм) с

60 мл смолы Дауэкс 1Х2 в гидроксильной форме. После промывания 200 мл воды негамицин элюируют 0,5 н. раствором НСм. После нейтрализации амберлиф том 1Р-45 (в гидроксильной форме) ак тивную фракцию высушивают при понижен ном давлении. Порошок-сырец гидрохлори622414 ца негамицина весом 300 мг имеет 21%ную чистоту, Порошок-сырец (ЗОО мг) гидрохлорица негамицина растворяют в 10 мл воды, раствор пропускают через колонку (циаметр 16 мм) с 60 мл амберлита СЯ° 50 (в аммониевой форме) и промывают дистиллированной водой. Вытекающий раствор отбираютфракциями объемом по 10 мл.

Активное вещество находится Во фракциях 57-96. Иэ фракции 57-84 получают

25 мг (чистота 68 мкг/мг) светло-желтоватого порошка негамицина, иэ фракции

75-85 — 20 мг бесцветного порошка чистого негамицина, из фракций 86-96—

19 мг негамицина (чистота 910 мкгlмл), 5

Пример 2. 130 л среды состава, %:

Глюкоза 3,000

Крахмал 1,0000

Соевая мука 2,0000 2О

Сухие дрожжи 0,5000

Карбонат кальция 0,3500

Пентагидрат сульфата меди 0,0005

Гептагидрат хлорида мар- 0,0005 ганца 25

Гептагидрат сульфата цинка 0,0005 помешают в изготовленный из нержавеющей стали аппарат для ферментации емкостью 200 мл, стерилиэуют30 мин при о r зо

120 С, инокулируют в асептических условиях 1,2 л культурированного бульона штамма АТСС 2 147 0, перемешивают с о скоростью 2ОО об/мин и аарируют 25 л воздуха в 1 мин в течение всего периода ферментации — 113 ч. Температуру

35 о поддерживают 27 С. рН 110 л бульона

СН - СН вЂ” Сй - Сн- Сн - С -ян — м — Сн — ооон

1 I I II мй ОН хП> О Са

Амфотерен, обладает -еильноосновными и слабокислотными свойствами.

Негамицин ингибирует рост грамотрицательных и грамположительных органиэ5О мов. При определении бактерицидного аффекта с использованием агара с мясным акстрактом и пептоном (чайную ложку культуры, выросшей as 20 ч в питателыой среде, размазывают в виде полоски) ин55 гибируются следующие организмы при слецующих концентрациях (величины в скобках показывают концентрации при частичном ингибировании), мкгlмл: (0 1 + 2,5 (с 2,Н 0)

Максимума поглощения в УФ-спектре в пределах 220-400 ммк не имеет.

Максимальные частоты поглощения в

ИК-спектре; (КВч):,3430, 3200, 3(50»

2950, 1660, 1590, 1405 ° 1320, 1140, 1050, 970, 890, 820, 720 см

Белый порошок, хорошо растворим в воде, не растворим в метаноле, этаноле, афирах, бензоле.

Дает положительную реакцию на нингидрин, реактив Гидона-,Смита и отрицательную реакцию на антрон и реактив Сакагучи. (рН 7,4, 63 мкгlмл) устанавливают 4,9 при помощи 1 л 6 í. HCF, а затем профильтровывают через 8 кг диатомовой земли. Включая воду, использованную для промывания фильтра, получают в обшей сложности 117 л фильтрата, который пропускают через колонку с 6,5 л амберлита 1RC-50 (70%-ная аммонийная форма).

После промывания водой негамицин элюируют 0,5 н. раствором аммиака, активный элюат объемом 3 л концентрируют до

495 мл (3520 мктУмл) при пониженном давлении; Концентрат пропускают через колонку с Дауэксом 1Х2 (гидроксильная форма), промывают 350 мл воды и алюиI руют негамицин 0,5 í. HCE . 180 мл активного элюата нейтрализуют 3 н. аммиаком, сушат и получают 5,5 г желтоватокоричневого порошка негамицина-сырца (чистота 294 мкг/мг). Общий выход

23,4%.

3,4 г порошка негамицина 29;.4%-ной чистоты растворяют в 22 мл воды, устанавливают рН 8,8 и вводят раствор в колонку (диаметр 26 мм), заполненную смолой амберлит CCz -50 в аммонийной форме. После промывания 500 мл воды через колонку пропускают 0,1%-ный амми- ак, элюат отбирают фракциями по 20 мл.

Негамицин обнаруживают во фракциях 69«

-81. Из фракций 69-73 получают 233 мг (90%-ная чистота) светло-желтоватого порошка негамициьа, из фракций 74-77 получают 383 мг чистого негамицина, иэ фракций 78-81 - 395 мг.

Антибиотик негамицин, обладающий антибактериальной активностью, имеет структурную формулу

622414

Staph .Rococcus aureus 2ovp

64aphyPococcue аи еие 193

6

Sarcina РМеа РС3-1001

Зас Иив ыиЬ666 ИЯР).-В АНУЯ

Е. coRi К l2

E.соб ЮНЮ

GhigeRRa Нвще ч

12,50 баRmonеИа 4yphosa

ИRebsieREa preuи оvus PCO 602

Gerakia marceecens

3,12

12,50 (6,25)

12,50 (6,25) Vrotецв vuRgaris 0ki9

Proteus reHga ri bA5iIL

Рвеиаоисонаь aeruginosa М- 3

6,25

12,50 (6,25) 25,00 (12,50) Pseudornonas Нио евсеив

6,25 (3,12) е b0T 100,00

В 0,5%-ном пептоновом агаре ингибируюший аффект выражен сильнее, чем в питательном агаре, и ингибируются сле35 дуюшие организмы - при следующих концентрациях (величины в скобках даются для частичного икгибирования), мгк/мл:

5.aureus 209Р

&.Rufea РСЗ -1001

Ъ.sub%i Pie K-12

1,56

5,00 (2,50) 1,56

12,50

E.ñîá М:)Н

1,56

S.kkexneri

3,12

6,25 (3,12) <0,7S

B.<) showa Pr, re Apart CN ЭЦ

B.marcescent

1>56

12,80 (3,12) N cabac

После того„как 20-часовую культуру, выращенную в питательном бульоне, разбавляют в 1000 раз и одну чайную ложку наносят в виде полоски, ингибирование роста наблюдается при половинной концентрации считая те концентрации, которые приведены выше.

В,ьцЬ6ба ММФ ЗЯ-&

К.pneumoniae PC3 b02

50,00

12,50 (6,12)

50,00

12,5 (1,56)

25,0 (12,5)

3,12 (1,56)

12,50 (3,12) lO

622414 Рв.ае1иф»новси К

Рв.ае» иф»нова И 46

6,25

3,12 (1,56) 50,00

Составитель Н. Бондаренко

Редактор Н. Хубларова Техред Н. Бабурка Корректор М. немчик.

Заказ 4720 Тираж 568 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Филиал ППП Патент», г. Ужгород,: ул. Проектная, 4

M.ВЕфН1абВ ЬОТ

НегаЬп»цин не ингибирует альбиканов при концентрации 100 мкгlмл, ингибирующий эффект его не снижается в присутствии сыворотки; например,E. Соб ингиби руетоя при помощи 3,12 мкг/мл негамици10 на во всех средах, содержащих сыворотку в концентрации 0,5. 10, 20, 40%.

Негамицин оказывает более сильное бактерицидное влияние при щелочных ве. личинах рН. Например, ингибирующая концентрация против Е.Cof» в 0,5%-ном пептоне в воде:при различных величинах рН следующая (в скобках даны концентрации для частичного ингибирования), мкгlмл . рН 5,0-12,5 .(3, 12); рН 6,0-12,5 (3,12) рН 7,0-3,12 (1,56); рН 8,0-1,56 (0,78); рН 9,0-1,56 (0,78).

При методе с цилиндрической пластинкой с использованием 0,5%-ного пептонового агара и Е.coRi К 12 концентра25 ция негамицина в 25 мкгlмл дает следующие диаметры ингибированных участков при следуюп1их величинах рН: 6,0-16мм, 7,0-20 мм,. 8,0-21 мм.

Негамицин обладает низкой токсично30 стью. При внутривенном впрыскивании. доэы в 400 мгlкг мышь погибает. Токсичных признаков не обнаруживается при ежедневном интраперитониальном введении

200 мг/кг мыши в течение 30-ти дней, Задержанной токсичности также не наблюдается.

При внутримышечном введении 50 мг/кг кроликам обнаруживается высокая концентрация в крови — 100 мкг/мл через 1 ч после введения и 80% выводится с мочей эа 24 ч, что показывает высокую концентрацию препарата в моче, например, 4480 мкгlмл в моче, взятой через 1-2ч после инъекции.

Формула изобретении

Способ получения негамицина, о т— личающийся тем,чтоштамм б » ер1омусее ри рео1ивсие

ATCC 21470 выращивают в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта.