Способ получения фторпроизводных l-тирозина

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к ферментативному синтезу фторпроизводных Ь-тирозина, применяемых в медицине в качестве фармакологически активных веществ. Целью изобретения является удешевление процесса и повышение безопасности технологии очистки целевого продукта. Способ заключается в том, что готовят биокатализатор, представляющий собой проявляющие тирозин -феноллиазную активность клетки Citrobacter inter- medius , включенные в 7-12%-ный криогель поливинилового спирта, а получение фторпроизводных L-тирозина ведут непрерывно в реакторе проточного типа , из полученного на выходе из реактора раствора целевой продукт выделяют упариванием в вакууме с последующей очисткой известными методами ионообменной хроматографии и перекристаллизации . (Л со ел ;о -vj 4

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК 1 ( (19) (11) (51) 4 С 12 N 11/04, С 12 .Р,.13/04 г.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4080496/31-13 (22) 23.06.86 (46) 15. 11. 87. Бюл. У 42 (7.1) Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова (72) Н.Г.Фалеев, В.И.Лозинский, М.С.Садовникова, Е.С.Вайнерман, С. Б.Рувинов, P.Ì.Сафиуллин, В.М.Беликов и С.В.Рогожин (53) 663.15(088.8) (56) T.Nagasawa, Т.Utagawa, I.Goto, С.- I.Kim, Y.Tani, Н,Kumagai °

Н.Yamada. Europ. J.Biochem. 1.981, ч. 117, р. 33-40.

Рогожин С.В., Лозинский В.И., Вайнерман Е.С., Долгтенко Л.В., Мамцис А.М., Иванова С.А., Штильман N.È. и Коршак В.В. Нековалентное криоконструирование в полимерных системах.

АН СССР, 1984, т. 278, с. 129-133, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФТОРПРОИЗВОД, НЫХ (-ТИРОЗИНА (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ферментативному синтезу фторпроизводных (-тирозина, применяемых в медицине в качестве фармакологически активных веществ.

Целью из обре тения являе тся удешевление процесса и повышение безопасности технологии очистки целевого продукта.

Способ заключается в том, что готовят биокатализатор, представляющий собой проявляющие тирозин -феноллиазную активность клетки Citrobacter intermedius, включенные в 7-12Х-ный криогель поливинилового спирта, а получение фторпроизводных,,-тирозина ведут непрерывно в реакторе проточного типа, из полученного на выходе из реактора раствора целевой продукт выделяют упариванием в вакууме с последующей очисткой известными методами ионообменной хроматографии и перекристаллизации. для получения биокатализатора, составляет от 7 до 12/. При меньшей, чем 7 концентрации полимера наблюдается некоторое вымывание включенных в криогель клеток, что нежелательно (снижается активность биокатализатора). При концентрации ПВС выше

12 . наблюдается также снижение активности, но из-за диффузионных затруднений в концентрированном геле (для

14%-ного геля — около б9 . от активности биокатализатора в случае 12 ного криогеля).

Режимы замораживания (температура и время) зависят от концентрации ПВС в исходной смеси, объема замораживания порции вещества, имеющегося холодильного оборудования. Предлагаемые режимы выбраны на основании экспериментов, и предусматривают температуру криогенной обработки от — 10

О до —.30 С и ее время от 12 до 24 ч.

Состав раствора и концентрации веществ, необходимых для биосинтеза фторпроизводных L -тирозина иммо6HJIH3oBGHHIIMH KIIe K H Citrobacter

intermedius, также найдены экспериментально, а использование ортоили мета-изомеров фтор-фенола дает возможность получать соответственно

3-фтор- или 2-фтор-тирозин.

Для выделения целевого продукта предлагается схема без использования органических растворителей: раствор, получаемый на выходе из проточного реактора с иммобилизованными клетками, упаривают при пониженном давлении (например, с помощью роторного испарителя), остаток перерастворяют в воде и наносят на колонку с катионообменной смолой в Н -форме (например, смола КУ-2); далее аминокислоту элюируют водным аммиаком и упаривают элюат досуха. После переосаждения и перекристаллизации получают очищенный целевой продукт °

Ниже приводятся конкретные примеры получения фторпроизводных L -тирозина данным способом.

Пример 1, 5 г влажной биомассы клеток Сitrobacter intermedius, содержащей 230 единиц тирозин-феноллиазы, суспендируют в 70 г водного раствора ПВС, содержащего 7,5 r полимера; после тщательного перемешивания полученную суспензию замораживают при -20 С порциями по 0,2-0,3-мл (время замораживания 18 ч). После от1 1351974

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ферментативному синтезу фторпроизводных оптически активной 1 -аминокислоты-l, -тирозина, r; которые могут быть использованы в медицине в качестве фармакологически активных веществ.

Цель изобретения — удешевление процесса получения и повьппение степени его безопасности.

Способ получения фтор-производных -тироэина включает следующие этапы.

Получение биокаталиэатора, т.е ° иммобилизацию клеток-, С 1гоЬасйег intermedius в криогель на основе поливинилового спирта (WIBC). Данная опе.рация осуществляется по общей схеме так называемого криоконструирования и заключается в смешении вод- 20 ного раствора ПВС с суспензией клетрк и дальнейшем замораживании порций полученной смеси при (-IO)о (-30) С в течение 12-24 ч, последующем оттаивании полученных частиц и их промывке от неиммобилизовавшейся части клеток.

Биосинтез фторпроизводных L-тироэина с помощью биокатализатора в реакторе проточного типа при пропуска- 30 нии через него раствора субстратов, содержащего, г/л: 0- илилс-фтор-фенол 2; пируват калия (натрия) 10; ацетат аммония 15; пиридоксальфосфат

0,025; рН раствора субстратов 8,08,3.

Выделение целевого продукта (2или 3-фтор-ь-тирозина) из раствора, получаемого после проточного реактора с иммобилизованными клетками. Оне- 4п рация выделения включает упаривание летучей части раствора при пониженном давлении, перерастворение остатка в воде и выделение аминокислоты на ионообменной колонке со смолой КУ-2 45 (в Н -форме) из смеси с другими веФ ществами реакционной массы. После элюирования целевого продукта водным аммиаком, упаривания элюата, его растворения в кислой среде фторпроиз- 5О водное -тироэина осаждается добавлением двууглекислого натрия и перекристаллизовывается из воды.

Выбор конкретных параметров предлрГаемого способа получения фторпроизводных L -тирозина обусловлен следующими моментами.

Концентрация раствора ПВС в суспензии с клетками, предназначенной

1351974 раствора ПВС, содержащего 6 г полимера; после тщательного перемешивания порции полученной суспензии объв, емом 0,3-0,4 мл замораживают при

I о

-30 С в течение 12 ч. После оттаиваи- ния частицы 12Х-ного по ПВС криогеля промывают стерильной водой и загрусо жают в проточный реактор, куда затем р- ip подают раствор субстратов такого же состава, что и в примере 1, имеющего рН 8,3. Раствор субстратов подают со скоростью 40 мл/час, собирая элюат к в сборник. За 1.0 дней непрерывной ра- .

15 боты накоплено 9,6 л элюата, который обрабатывают, как в примере 1. Получено 23 г З-фтор-1-тирозина, константы вещества аналогичны примеру 1. а- Предлагаемый способ получения к 2р фторпроизводных4 -тирозина дает возт можность синтезировать целевой продукт в одну стадию и с абсолютной энантиоселективностью; удешевляет процесс получения за счет использон- 25 вания целых клеток Citrobacter intermedius взамен дорогому очищенному ферменту — тирозинфенол-лиазе. Кроме того, данный способ увеличивает продолжительность функционирования биьЗр катализатора, что позволяет длительс- ное время непрерывно получать целевой продукт. Так, например, даже через 2 мес. иммобилизованные в криогель ПВС клетки продолжают работать и катализировать синтез фторпроизводных С -тирозина.

Использование проточных реакто\ ров (известной конструкции) и непре" рывных режимов работы биокатализато4О ра улучшает технологичность процесса получения фторпроизводных Ь -тирозина. м Предлагаемая схема выделения це левого продукта повышает безопасность процесса, так как позволяет отказать4 ся от использования органических

) °,растворителей — вся очистка проводито ся в водной среде. таивания частицы 10Х-ного по ПВС криогеля промывают стерильной водой и загружают в проточный .реактор куда затем подают раствор субстрато содержащий, г/л: о -фтор-фенол 2; пи руват калия 10; ацетат аммония 15 и пир доксальфосфат 0,025 (рН раствора 8,2)

Раствор субстратов подают непрерывно скоростью 45 мл/ч, собирая элюат в сба ник. За 10 дней непрерывной эксплуа тации накоплено 10,8 л элюата, кото о рый упаривают при 55-60 С и понижен ном давлении (16 мм рт.ст.). Остато перерастворяют в воде, наносят на колонку (i л) с ионообменной смолой т

КУ-2 (Н -форма) и промывают колонку водой до нейтральной реакции. Амино кислоту элюируют 5Х-ным водным амми ком, элюат упаривают досуха. Остато растворяют в 1М НС1 а затем осаждаю целевой продукт прибавлением бикарбоната натрия. Выпавший осадок отде ляют, промывают холодной водой и пе рекристаллизовывают из дистиллирова ной воды. Получают 25 г 3-фтор-1-ти розина (Найдено, Х: С 54,26; Н 5,07

N 7,09. Вычислено, Х: С 54,27; H

НС1).

Пример 2. 5 г влажной биома ,сы клеток Citrobacter intermedius содержащих 215 единиц тирозин-фенол лиазы, суспендируют в 95 г водного раствора ПВС, содержащего 7 г полимера; после тщательного перемешивания порции полученной суспензии объ емом 0,1-0,2 мл .замораживают при

"-10 С в течение 24 ч. После оттаива иия частицы 7Х-ного по ПВС криогеля промывают стерильной водой и загружают в проточный реактор, куда зате подают раствор субстратов, содержащий, г/л:.и--фтор-фенол 2; пируват натрия 10; ацетат аммония 15 и пири доксальфосфат 0,025 (pH раствора 8, О

Раствор субстратов подают непрерывн со скоростью 50 мл/ч, собирая элюат в сборнике. За 10 дней непрерывной эксплуатации накоплено 12,0 л элюата, который обрабатывают, как в примере 1. Получают 18 r 2-фтор-1-тирозина (Найдено, Х: С 54,34; Н 5,16; N 6,90.

Вычислено X: С 54, 7; Н 5,06; N

7,03); - D =-1,40 (с 4, 1И НС1).

Пример 3. 5 r влажной биомассы клеток Citrobacter intermedius, содержащих 250 единиц тирозинфеноллиазы, суспендируют в 45 r водного

Формула изобретения

Способ получения фторпроизводных -тирозина, предусматривающий приготовление субстрата из фторфенолов, пирувата и аммиака, смешение их с биокатализатором, обладающим тирозин-фенол-лиазной активностью, проведение реакции синтеза в оптимальных для нее условиях с последующим вьфелением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, Составитель 3. Фапунина

Редактор И.Сегляник Техред Л.Сердюкова Корректор С.Шекмар

Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 5541/23

Производственно-полиграфическое предприятие, r.Ужгород, ул.Проектная, 4

S 1351974 б с целью удешевления процесса полу- medius, включенные в 7-12Х-ный криочения и повышения степени его без- гель поливинилового спирта, а проопасности, в качестве биокатализатора цесс синтеза ведут непрерывно в реакиспользуют клетки Citrobacter inter- „торе проточного типа.