Способ получения восстановленного цитохрома с

 

Изобретение относится к биохимии , а именно к энзимологии. Целью изобретения является ускорение процесса и улучшение качества целевого продукта за счет увеличения степени его .восстановления. Способ включает приготовление раствора цитохрома С, внесение его в электрохимическую ячейку , пропускание постоянного электрического тока плотностью 0,06- , 0,12 мА/мм в течение 2-4 мин и одновременное воздействие на раствор ультразвуком мощностью 250-350 Вт и частотой 22+1,65 кГц. 1 табл. с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (!9) (11) (59 4 С 12 ) 1/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ СЮ((ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ/, „,, ц/ к Авторском свидятальствм Йфр ..., " / а,. t (21) 4003255/28-13 (22) 30.12.85 (46) 07.05.88. Бюл. У 17 (71) Горьковский государственный медицинский институт им. С.И.Кирова (72) Е.М.Хватова, В.Ф.Давыдов, П.П.Загоскин и Э.В.Ягутов (53) 577.15(088.8) (56) БЫее T.W. The distribution of

cytochromeoxidase activity in rabbit

brain.-Biochem, J., 1967, v.102, 11 2, р. 612-617.

Cass А.Е G. et al. Electrochemical, photoelectrochemical, electrocatalytic and catalytic reduction

of redox proteins. — Nature, 1980, ч,285, У 26, р, 673-674. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ. ВОССТАНОВЛЕННОГО ЦИТОХРОМА С .(S7} Изобретение относится к биохи-: мии, а именно к энзимологии. Целью изобретения является ускорение процесса и улучшение качества целевого продукта за счет увеличения степени его восстановления. Способ включает приготовление раствора цитохрома С, внесение его в электрохнмнческую ячейку, пропускание постоянного электрического тока плотностью 0,062

0,12 мА/мм в течение 2-4 мин и одновременное воздействие на раствор ультразвуком мощностью 250-350 Вт н частотой 22+1,65 кГц. 1 табл.

1393348

Изобретение Огно ится к биохимии„ а именно к энзимологии„ и касается усовершенствования метода восстановления цитохрома С вЂ” редокс-белк-.. используемог0 для определения GKYNBff005 ти некоторых оки "лительнс-восстанов:-.-.тельных ферментов, например цитсхрсмоксидазы.

Цель изобретения — ускорение про= цесса и улучшение качества целевого продукта за счет увеличекпля степени его восстансвленности.

Способ эаключаетсsf » токл„ что для электрсхимячесKОгс восi tановлpния пиioxpof!a в электрскикпгческсй ячейке с двумя инцифферентнъппл электродаии из благородного металла через раствор цитохрома С пропускают постоя:: ный электрический ток ппотностью 0„060,12 мА/мм и OpHQBðåìåíío обрабатывают его ультразвукзм мощностью 250300 Бт и частотой 22 !,65 кГц в течение 2-4 мин. Раздельное использование ультразвука или электрического тока 25 неэффективно. Предложенный способ позволяет ускорить процесс в 5 раз, а также увеличить степень восс.гансв- леннссти от 2-14 до 25 -87 .

Пример 1. Взвешивают 61,5 мг цитохрома C фирмы (ФРГ и растворя-ют z 50 мл дистиллированной воды (пригОтОвляют всдньБл pGcTBop цитОхрс ма С концентрацией 10 М). Вносят готовый ра< твор в стеклянный химичес- l I кий стаканчик с двумя платиновыми электродами, выполненных иэ платинсBoff проволоки длиной 100 мм и диамет-; ром 1 мм каждый, подключенных к универсальному источнику питания, Вводят 4 магнитострикционный излучатель ульт=развуковогс диспетчера в раствор цитохрома С.

В течение 3 мин производят одно" временное пропускание постоянного

45 электрического тока плотностью

0,09.мА/мм и озвучивание раствора ультразвуком мощностью 30 Вт с частотой 22+1,65 кГц. Переносят 3 мл раствора цитохрома С из стаканчика в

5" спектрофотометрическую кювету с д;тиной оптического пути 0,,3 см и записывают спектр поглощения цитохрома С на спектрофотометре в диапазоне 480580 нм. Б ту же кювету с раствором цитохрома С добавляют несколько крис- " талликов гидросульфата натрия, перемешивают и вновь записывают спектр поглощения цитохрома. С, Пс диаграммам залиси спектров рас- считывают степень восстансвленности цитсхрома С по отношению к максимальному восстановлению, достигаемому с помощью гидросулъфита натрия. Расчет прои"=-водят по формуле:

Х==-х100, h c

eL где Х вЂ” степень восстансвленности, ;

Ъ - высота ос -пика в спектре Ы

II0I IIo ÿeния цитсхрома С ° восстановленного предлагаемым электрохимическим способом, "у °

f I

Ь,- высота ос -пика в спектре

Р поглощения цитохрома С, всс" TàíîBIIeííoão гидросульфитом натрия, мм.

Степень восстансвленности цитохрома С 87, П р и м е p " Спссоб осуществляют аналсгично примеру 1 при следующих параметрах: плотность тока

0,06 мА/мм ; мощность ультразвука

2, 250 Вт; частота ультразвука 221

+1,65 кГц, . время 2 мин, Степень восстаповленнссти цитсхрома С 32 .

П р ::: „ e p 3. Способ осуществляют аналоги-. нс пр1лк1ер т 1 при следующих г параметрах: Ifëîòíoñòü тока 0>12 мА/мм; мощность ультразвука 350 Вт; частота ультразвука 22+1,65 кГц; время 4 мин.

Степень вос.становленности цитохрома

С 64%.

В таблице приведены данные зависимости степени восстановленности цитохрома С от плотности, мощности и частоты ультразвука и.времени их воздействия.

При разработке данного способа npo" ведено 30 экспериментов, в результате которых выявлены оптиклальные и граничные значения параметров плотности. тока, мощности и частоты ультразвука, а также времени сочетанного воздействия постоянного электрчческого тока и ультразвука. Во всех опытах (5 опытов), проведенных при оптимальных значениях использованных физических факторов, степень зосстановленнос ти цитохрома С в среднем 87+1 .

Воздействие ультразвука при иэбраинь|х в качестве оптимальньп параметрах мощности и частоты не вызывает денатурационных изменений в белковой части цитохрома С, т.е, не изменяет его физико-химических и каталитических свойств„ Это доказывается слектрсфо3

139 тометрически (сохранение неизменного спектра поглощения цитохрома С после ультразвуковой обработки) и энзимологически (сохранение способности к автоокислению и окислению цитохромбксидазой в той же степени, что и у цитохрома С, восстановленного известными способами). Следовательно, использование ультразвука в .комбинации с постоянным электрическим током для восстановления цитохрома С правомер но. .Таким образом, комбинированное воздействие постоянного электрического тока и ультразвука в оптимальных параметрах позволяет в 5 раз ускорить процесс восстановления цитохрома С и в 1,5-2 раза увели .ить степень его восстановленности, Применение предлагаемого способа позволяет заменить конструктивно сложную электрохимическую ячейку с разделенным катодньж и анодным пространством на обычный химический стаканчик.

3848

Предлагаемый способ позволяет проводить восстановление цитохрома С без применения промотора транспорта электронов.

Формула и з обретения

Способ получения восстановленного

10 цитохрома С, включающий приготовление раствора цитохрома С, внесение его в электрохимическую ячейку с двумя нндиААерент пгми электродами из благородного металла и последующее его . восстановление путем проттускания постоянного электрического тока, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью ускорення процесса и улучшения качества целевого продукта за счет

2П увеличения степени его восстановленности, при пропускании тока осуществляют одновременное воздействие на раствор ультразвуком мощностью 250350 Вт и частотой 22+1,65 кГц в те25 чение 2-4 мин, а плотность тока устанавливают равной 0.06-0,12 мА/мм

0 05

25

0,06

61

0,09

87

0,12

28

0,)3

48

0,09

25

36

0,09

0,09

62

25

0,09

0,09

5l

0,09

0,09

83

300 22+1,65

300 22+1,65

300 22+1,65

ЭОО 22+1,65

300 22+1,65

200 22+1,65

250 22+1,65

350 22+1,65

400 22+1,65

300 44+4,4

300 22+1,65

300 22+1,65

300 22+1,65

3 !8

3 20

3 22

3 35

3 18

3 20

3 45

3 62

3 .68

1 20

2 21

4 38

1393848

Продолжение таблицы

5 66

0,09

57

0,06

0,12

0,.09

3 )8

68

0,09

5 19

0,09

)О

0,09

3 19

О

5 60

IT р и м е ч а н и е. Величина "кига", использованных параметров мощности и частоты УЗ, и плотности тока на электродах обусловлена техническими характеристиками приборов УЗДН-2Т и УИП-1.

Каждая группа опытов включает 5-10 экспериментов.

Редактор Н.Рогулич

Заказ )94I/27 Тираж 520

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно †полиграфическ предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

300 22+1,65

250 22+1,65

350 22+1,65

300 22+1,65

300 22+1,65

2 )9

4 50

30 22

90 36

Составитель В.Муромец

Техред М.Ходанич . Корректор С.Черни