Способ определения повреждения клеток грамотрицательных бактерий

 

Изобретение относится к микробиологии , а именно к технике анализа повренщения бактериальных клеток. Целью изобретения является повышение точности определения повреждения грамотрицательных бактерий. Для этого к клеточной суспензии добавляют додецилсульфат натрия в концентрации от 10 до . Затем на нее накладывают переменное электрическое поле. Определяют отношение величин электросриентационно го эффекта в поле мегагерцевых и килогерцевых частот в пробе и в контроле. Уменьшение этого отношения в пробе в сравнении с контролем более чем на 30% является критерием определения повреждения внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Определение величины электроориентационного эффекта в поле мегагерцевых частот проводят на час тоте, находящейся в диапазоне высокочастотного спада эффекта. Использование способа обеспечивает увеличение точности анализа за счет выявле-- ния повреждения внешней мембраны клеточной оболочки при отсутствии повреждения цитоплазматической мембраны . Кроме того, дополнительное увеличение точности анализа достигается за счет оптимального выбора частоты поля в мегагерцевом диапазоне частот, 2 табл. с S СО 00 00 .4; ел

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

M ABTQPCH0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4136108/31 — 13 (22) 17. 10 ° 86 (46) 15.04.88. Бюл. К - 14 (71) Институт биологической физики

АН СССР и Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микро биологии (72) А.Ю.Иванов, В.M.Ôîì÷åíêoâ и А.И.Мирошников (53) 576.8.095 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р 469748, кл. С 12 М i/34, 1973.

Авторское свидетельство СССР

У 1096280, кл. С 12 Q 1/02, 1982, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ

КЛЕТОК ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ (57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к технике анализа повреждения бактериальных клеток.

Целью изобретения является повышение точности определения повреждения грамотрицательных бактерий, Для этого к клеточной суспензии добавляют додецилсульфат натрия в концентрации

„„SU„„)l 388425 А 1 (5Н 4 С 12 Q 1/02, С 12 N 13/00 от 10 до 2 10 М. Затем на нее накладывают переменное электрическое поле. Определяют отношение величин электроориентационного эффекта в поле мегагерцевых и килогерцевых частот в пробе и в контроле. Уменьшение этого отношения в пробе в сравнении с контролем более чем на 30Х является критерием определения повреждения внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Определение величины электроориентационного эффекта в поле мегагерцевых частот проводят на частоте, находящейся в диапазоне высокочастотного спада эффекта. Использование способа обеспечивает увеличение точности анализа за счет выявле-. ния повреждения внешней мембраны клеточной оболочки при отсутствии повреждения цитоплазматической мемб- С раны. Кроме того, дополнительное увеличение точности анализа дасти- 2 гается эа счет оптимального выбора

twas частоты поля в мегагерцевом диапазоне частот. 2 табл. СлР

1388425

20

ЗО

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в промышленности для определения повреждения клеток на различных стадиях биотехнологического процесса.

Цель изобретения — повышение точности определения повреждения грамотрицательных бактерий, Пример 1. В качестве модели клеток с поврежденной внешней и неповрежденной внутренней (цитоплазматической) мембранами берут клетки, обработанные трилоном Б (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) в концентрации 10 M. Известно, что трилон Б в укаэанной концентрации вызывает повреждение внешней мембраны клеток Е.coli не нарушая барьерных свойств их цитоплазматической мембраны.

Для определения повреждения клеток грамотрицательных бактерий Escheri, chia coli К-12 трилоном Б исходную суспензию клеток дважды отмывают в дистиллированной воде с последующим центрифугированием, помещают в трис-НС1 буфер (10 М, рН 8,0) и делят на две части. Одну из них используют в качестве интактных клеток с неповрежденной внешней мембраной, а к другой добавляют трилон Б до конечной концентрации 10 М. Обе части инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.

Затем интактные и обработанные. клетки дважды отмывают в дистиллированной воде с последующим центрифугированием и ресуспендируют в воде и задают следующие параметры суспензии: оптическая плотность 0,13 (длина световой волны 540 нм, толщина кюветы 1 см), удельная электропроводность 2,4.10 Ом м, рН 5,0.

Затем каждый образец (интактные и обработанные клетки) делят на две части. Одну из них используют в качестве контроля, а к другой добавляют додецилсульфат натрия в концент.

-ф — 4 рации от 10 до 2 10 М.

Додецилсульфат натрия (ДСН) широко используется в бактериологии для растворения изолированных клеточных

Ъ стенок и цитоплазматических мембран с целью их последующего фракционирования, В предлагаемом способе введение ДСН в концентрации от 10 до

2 -1О M позволяет обнаружить повреждение внешней мембраны грамотрицательных бактерий, без нарушения целостности клеток. Действительно, при обработке этих бактерий с неповрежденной внешней мембраной ДСН в

-4 концентрации 2 ° 10 М и ниже не наблюдается нарушения барьерных свойств внутренней цитоплазматической мембраны, так как неповрежденная внешняя мембрана является дополнительным барьером для ДСН и защищает цитоплазматическую мембрану от повреждающего действия этого поверхностно-активного вещества. Если же внешняя мембрана клеток повреждена, то ДСН нарушает барьерную функцию цитоплазматической мембраны и значительно уменьшает величину отношения ЭОЭ в поле мегагерцевых и килогерцевых частот.

Электроориентационный эффект клеток определяют на устройстве для контроля физиологического состояния клеток.

С целью оптимального выбора часто ты, при которой определяют электроориентационный эффект (ЭОЭ) в мегагерцевом диапазоне, вычисляют значе- ния относительного изменения величины отношения Р ЭОЭ клеток с неповрежденной внешней мембраной в мегагерцевом диапазоне к таковой в килогерцевом (10 Гц) диапазоне для разф ных частот мегагерцевого диапазона, Полученные данные представлены в табл,1.

Из табл,1 видно, что максимальное изменение относительной величины

Ьp/P, при добавлении додецилсульфата натрия имеет место в случае, если частота поля задается в области высокочастотного спада ЭОЭ, т.е. в

6 7 пределах 10 -10 Гц. В этом случае обеспечивается максимальная чувствительность при определении повреждения внешней мембраны клеток, повышается точность анализа.

У клеток с неповрежденной внешней мембраной величина относительного изменения Р при добавлении додецилсульфата натрия также изменяется из-за изменения электрических свойств клеток при адсорбции его на их поверхности. Однако у неповрежденных клеток 6P/P не превышает 207., в то время как у клеток с поврежденной внешней мембраной / //3, составляет

Ф при концентрации ДСН 2 10 М и мега6 7 герцевой частоте 10 — 10 Гц 39

76Х.

1388425

Пример 2. Определяют повреждение бактериальных клеток Escherichia cali К-12 трилоном Б, Процедура и условия обработки клеток трилоном

Б такие же, как в примере 1. Параметры клеточной суспензии, установка для проведения измерений и последовательность операций аналогичны примеру 1, кроме концентраций додецилсульфата натрия, которая в этом примере равна

10 М. Результаты приведены в табл.1.

В этом примере также повреждения внешней мембраны клеток выявляются при добавлении доцецилсульфата натрия 15 и сопровождается уменьшением относительной величины 6 p/! при мегагерце6 вой частоте поля в диапазоне 10

10 Гц на 30-411, II р и м е р 3, Определяют повреждение бактериальных клеток Escherichia cali К-12 трилоном Б. Процедура и условия обработки клеток трилоном

Б, а также параметры суспензии, установка и последовательность операций такие же, как и в примере 1, кроме концентрации дадецилсульфата натрия, -4 которая в этом случае равна 1,5.10 М.

Результаты измерений приведены в— табл.1. 30

Как видно из табл, в этом примере также выявляется повреждение внешней мембраны клеток при добавлении додецилсульфата натрия и сопровождается уменьшением относигельной вели35 чины д /Р, при мегагерцевой частоте поля в диапазоне 10 -10 Гц на 34,56

58,5%.

Добавление дадецилсульфата натрия

-4 в концентрации свыше 2"10 М приво- 4 дит к недопустимо большому увеличению удельной электропроводности суспензии (до 10 Ом м и выше), диапазон концентраций, позволяющих надежно абнаружHzr» повреждение внеш 45 ней мембраны клеток, составляет от

10 до 2 10 М.

Из примеров 1-3 (см.табл,i) видно, что и=:ìåíåíèå а!3/ t3, при введении додецилсульфа.." натрия в концентрации от t0 ;to 2 ° 10 И на величину свыше

307 служит надежньп критерием определения повреждения внешней мембраны граматрицательных бактерий.

П р и и е р 4. Определяют повреж55 дение тpns;nacм Б штамма грамотрицатель!н..х ба:стерий, а именно Езс11ег ь—

chia coli ЖЕ-600, Процедура и условия обработки трилоном Б такие же, как в примере 1. Параметры анализируемых суспензий следующие: оптическая плотность 0,26, удельная электропроводность 2 ° 10 Ом м, рН 4,7.

Установка, на которой проводят измерения, и последовательность операций аналогичны примеру 1.

Результаты приведены в табл,2, В примере 4 повреждение внешней мембраны клеток в.является г.ри добавлении додецилсульфата натрия и сопровождается уменьшением относительной величины !!P /P более чем на 307, а именно в области высокочастотного спада электроориентационного эффекта примерно на 607, Таким образом, использование предлагаемого способа определения повреж-. дения клеток грамотрицательных бактерий обеспечивает увеличение точности анализа за счет выявления повреждения внешней мембраны клеточной оболочки при отсутствии повреждения цитоплазматической мембраны. Кроме того, дополнительное увеличение точ-ности анализа достигается путем увеличения чувствительности (примерно в 2 раза) измерений за счет оптимального выбора частоты поля в мегагерцевом диапазоне частот (в области высокочастотного спада электроориентационного эффекта). формула изобретения

Способ определения повреждения клеток граматрицательных бактерий, включающий помещение исследуемых и эталонных образцов клеточных суспензий в переменное электрическое поле, определение величин электроориентационного эффекта в поле мегагерцевых и килогерцевых частот с последующей оценкой по отношению измеренных величин, а т л и ч а ю щ и йс я тем, чта, с целью повышения точности определения, перед помещением в пол . в образцы вводят додецилсуль4 фат натрия в концентрации 10

-4

2 10 М, причем величину электраориентационного эффекта в поле мегагерцевых частот определяют на частоте, находящейся в диапазоне высокочастотного спада эффекта.

1388425

Т а б л и ц а 1

КонцентраЧастота в мегагерцевом диапазоне, Гц

Клетки ция додецилсульфата натрия, М

5 10 10

5 10

ЬP р у /о

bP у о

2,14

Клетки с

2, 10

1,77 1,04

1,5 10

2,28 6,1 2,20 4,8 1,58 10,7 0,91 12,0

224 47 218 38 164 74 092 115

2307533360152140,91125

2 10

2,16

2,11

1,28

Клетки с

1,5 10

1,78 17,5 1,48 30 0,68 47 0,36 41

2 -10

1,60 26 1,29 39 0,29 77 0,14 76

П р и м е ч а н и е, bP — абсолютное изменение величины Р у обработанных додецилсульфатом натрия клеток по сравнению с величиной 8 для контрольных клеток.

Таблица 2

Частота в мегагерцевом диапазоне, Гц

Концентрация додецилсульфата натрия, М

Клетки

5 ° 10

10 ь

% (у Ф

aР ьр р у а Ж р у о )з p о

1,77

1,48

1,25

1,27 2

Клетки с неповрежденной внешней мембраной

1,59

2 ° 10.1,90

1,16

1,80

Клетки с поврежденной внешней мембраной

2 ° 10

58 0 46 60

35 0,65

1Ф 17

Составитель А.Федоров

Техред А.Кравчук Корректор А,Тяско

Редактор Н,Киштулинец

Заказ 1549/28

Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская араб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 неповрежденной внешней мембранои поврежденной внешней мембраной

1,68 21,75 1,38 34,5 0,35 62

0,61

0,25 58,5