Способ определения миоглобина

 

Изобретение касается биологии, исследования биологических веществ, а именно миоглобина, предназначенного для ранней диагностики ряда заболеваний и патологических состояинй, сопровождающихся гипермиоглобинемией и миоглобинурией. Цель изобретения - повышение точности способа за счет повышения чувствительности метода определения миоглобина в реакции гемагглютинации. Для зтого получают специфические иммуноглобулины класса G.Антитела вьщеляют колоночной аффинной хроматографией на иммуносорбенте с иммобилизированным миоглобином. Импульсную сыворотку против миоглобина циркулируют через иммуносорбент со скоростью 5 мл/г 13-18 ч. После отмывки с иммуносорбента неспецифически связанных белков осуществляют элюцию антител 0,2 м глицин - НС1 - буфером, рН 2,2. Фракции со специфическими антителами объединяют, подщелачивают до рН 8,0 и диалиэуют против 500-кратного объема 0,01 М карбонатного буфера, рН 9,6. Концентрацию специфических антител против миоглобина определяют из спектрофотометрических данных при Л 280 им, используя коэффициент экстинкции 1,98x10 М -см . Ставят реакцию гемагглютинации: сенсибилизированнь е амнУноглобулинами формалинизированные эритроциты кур против миоглобина. Реакцию проводят с помощью хлорида хрома и танина. Оптимальными установлены соотношения антител к эритроцитам

СООЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (5L ) 5 G 01 N 3 /48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ,(46) 15. I2..90. .Бюл. .В 46 (21) 4093379/28-14 (22) 16.05.86 (71) Горьковский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии, Научно-исследовательский институт медицинской радиологии

ANH СССР и Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) Г.М. Лапшина, Т.В. Блинова, Г.М. Ротт, Т.Г. Бирюкова, И.И. Староверов, A.M. Поверенный, М.Я. Руда °

И.Н. Блохина, А.Ф. Цыб и Е.И.Чазов (53) 615.373(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

В 943573, кл. А 61 К, 39/00, 1982, {непубликуеиое (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИОГЛОБИНА (57) Изобретение касается биологии, исследования биологических веществ, а именно миоглобина, предназначенного для ранней диагностики ряда заболеваний и патологических состояний, сопровождающихся гиперииоглобинемией и миоглобинурией. Цель изобретенияповышение точности способа за счет

-повышения чувствительности метода определения миоглобина в реакции гемагглютинации. Для этого получают специфические иммуноглобулины класса

„.SU„„1415916 А1

G.Àíòèòåëà выделяют колоночной аффинной хроматографией на иммуносорбенте с имиобилизированным миоглобином. Им» пульсную сыворотку против миоглобина циркулируют через иммуносорбент со скоростью 5 мл/г 15-18 ч. После отмывки с иммуносорбента неспецифически связанных белков осуществляют элюцию антител 0,2 м глицин — НС1— буфером, рН 2,2. Фракции со специфическими антителами объединяют, подщелачивают до рН 8,0 и дналиэуют против 500-кратного объема 0,01 М карбонатного буфера, рН 9, 6. Концентрацию специфических антител против миоглобина определяют иэ спектрофотометрических данных при 1 280 нм, ис- 3 пользуя коэффициент экстинкции

1,98х10 М си . Ставят реакцию геиагглютинацин: сенсибилизированные аммуноглобулинами формалинизированные эритроциты кур против миоглобина. Ре- Я акцию проводят с помощью хлорида хрома и танина. Оптимальными установле- в® ны соотношения антител к эритроцитаи ф» (16-3,2) 10 . Повышение коэффициента шиа приводит к спонтанной агглютинации ф эритроцитов и снишению воспроизводимости метода приготовления препарата, а уменьшение - к падению чувствительности диагностикуиа.

14 5916

И.»обретение относ»»тг я к области

l»c(ëå:»î»»ания биологических веществ, а именно миоглобина, и может быть использог»а»»о в различных биохимических исследованиях, в частности для ранней диагностики ряда заболеваний и патологических состояний, сопровождающихся гипермиоглобинемией и миогло-, бинурией. 1О

Целью изобретения является повышение точности способа за счет ловыщения чувствительности метода определения миоглобииа в реакции гемагглютина ц»»и. 15

Процесс выделения и очистки миоглобина, получение гипериммунных сывороток против миоглобина осуществля:от в соответствии с известными методами. 20

Спец»»фические иммуноглобулины класса G получают из гипериммунных сывороток от многократного и длительно иммунизированных животных. Антитела выделяют колоночной аффинной хромато- 25 графией на иммуносорбенте с иммобилизированным миоглобнном. Приготовление иммуносорбента осуществляют известным методом с использованием BrCN активированной сефарозы 4В в качестве матри.1О цы, Иммун»»ую сыворотку против миоглобина циркулируют через иммуносорбент со скоростью 5 мл/ч в течение 15-18 ч при комнатной температуре. После отмывки с иммуносорбента неспецифических связанных белков осуществляют элюцию антител 0,2 м глицин-НС1-буфером, рН 2,2, Скорость пропускания буфера 5 мл/ч. Фракции, содержащие 4О специфические антитела, объединяют, подщелачивают до рН 8,0 и диализуют против 500-кратного объема О, 1 М карбонатного буфера, рН 9,6.

Концентрацию специфических антител45 ггротив миоглобина определяют из спектрофотометрическ»»х данных при длине. волны 280 нм, используя молекулярный коз< »фициент экстинкции 1,98х х10 М см . Выделенные антитела г хранят при -20 С. о

Формалинизация куриных эритроцитов.

Собирают кровь от 200-300 бройлеров во флаконы с раствором Олсвера в соотношении 1:1. Флаконы помещают ,55 в холод»»льник на 3-4 дня. Плазму уда»" ляют, эритроциты от.а»нают центрифуги1,ованием трижды н 20-крат»»ом объеме физиологическог» растнора. Готовят

507-ную взвесь клеток в физиологическом растворе.

К 507.-ной взвеси клеток прибавляют 5-кратный объем физиологического раствора, содержащего 4% формальдегида и 0,57. глюкозы, рН 7,0.

После перемешивания в течение 30 мин при комнатной температуре смесь переносят в холодильник (4 2 С), выдерживают в течение недели с ежедневным ресуспендированием эритроггг»тов. Через неделю надосадочную жидкость сливавт, а осадок эритроцитов взвешивают в физиологическом растворе, содержащем 4% формальдегида, рН 7,0. Хранят формалинизированные эритроциты в виде 507, взвеси при 4+2 С.

Отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов устанавливают следующим образом.

В несколько лунок полистироловой пластины вносят по 50 мкл физиологического раствора и по 25 мкл 27.-ной взвеси формалинизированных эритроци" тов. Если через 20-30 мин эритроциты осядут в виде четкой точки, то они могут быть использованы для дальнейней работы. Сенсибилизация формализированных эритроцитов иммуноглобулинами класса против миоглобина.

Сенсибилизацию формалинизированных куриных эритроцитов иммуноглобулинами против миоглобина проводят с помощью хлорида хрома и танина. В специальных экспериментах была подобрана оптимальная концентрация специфических иммуноглобулинов класса

G на 1 эритроцитарную клетку, обеспечивающая высокую чувствительность диагностического пр; рата, Оптималь-. ными установлены соотношения антител к эритроцитам (1,6-3,2) 10 . Повь»шение значений коэффициента пр»»водило к спонтанной агглютинации эритроцитов и снижению воспроизводимости метода приготовления препарата, а уменьшение - к падению чувствитель— ности диагностикума, Пример !. Приготовление диагностикума при введении в реакционную среду 1,6 !0 молекул имму»»оглс— булинов класса G па 1 эритроцитар»»ук» клетку.

К 1 объему раствора антител против миоглобина в концентрации

400 мкг/мл добавляют 8 объемов ди»стиллированной воды, 1 объем 507-.»ой

e3»»си фо1>мз <«".f1;lftftf t кУРц«тов lt 1 ог т < и 0,37 — «ог > рл-1 к<в рл хлоридл хрсмл. Смесь инку<>ируктт при t;oc1n>Ife ««с емешивании 15В

20 мик при ком«лткой температуре, после чего эритр<>питы трижды о1> ывлют центрифугированием при 1<000 ot / син в тече«ие 10 ми«. 0.:адок эритроци ок сусле«дируют к растворе эащитнсй срс- 10 ды, состоящей «3 1, ?. б >pftof кислоты, О, 57. буры, 107 слхлрозы, 1l бычьего cltftnpn1,> t!Iot o л альбу«ина до

?,57.-ной концен-рации и л<п>филизируют, 1В

Пример 2. Пригот< к«екпс ди. аГНОСтИКУМЛ ПРК ВКЕДЕК;<И К Рс IXIIIIOII ную среду 3, 2 10 tsttexyо1 буликов кл:,г.сл !. кл 1 зритроц.trapffyx>

20 клетку, К 1 объему рлстнорл лнт«гел гt>vтив миоглоби«а к кofft!et-тр;<ции 800 мк/м < добавляют 8 объемов дистиллирова«кой воды, т об ьем 507,-«ой взвеси формллинизировлн«ых xypftftf.fx эритроциток 25 и 1 объем 0,37.-«ого раствора >слорида хрома. Roc>tegvwtftc. операции проводят по примеру 1.

Специфическую активность зрит оцитаркого пил »«остикума определяют 30 в реакции пассив«ой гсмагглютинлции (РПГЛ), В 1б лу«с к пластинь< с t, -образнь.м профилем лунок вносят по .>Омкл физиологического раствора. В первую лунку вносят 50 мкл рлствора и:<огло> бина с конце нт,:аци-..й 1 мкг/мл и проводят em пос.ледовлтельные двукратные разведения пут< и переноса 50 мкл из лунки в лунку. В,две к«<трольные лунки миогr(t>t»!Il не кносяг. Затем во все лунки дс блвяяют по 25> мкл 1Ж--кой взвеси эритр< цитов с ttstftnf>tt>lttaftpoванными «л «их л«тителами к миоглобину, Плас тину вcтряхиплюп и nсзлвляют при Koftft;ttf loft те< лерлтуре. 1ерез 45

20-30 мик прок<>дят у .ет рсзультлтог..

В xoft rpn «ü«xx >Ii nttfcTII должны pB clip < дс ля т f,< я It !!х т<тчки нл д«е <у кк «, «то с г tleòe>II ствует об oòсут< гк«и < лмопро«<«о>1 кой

50 агглк тина ц«и i) t t Tp<. tlf<т н.

li»lt .>т«<-и с, tt A r, чпит, б- I 0 аг/ . 1 л«>гинлция «лб><юллепсз í «ерг«,,х 9 лу«к, х плас-,икы, чтс соответствует

>й Бык вля е<гой K 3 ë:I(с нт1>лции миоглс билл, рл <«ой . мг/<л. При использовлкии дилгн«< тикума, приготовлен«с."о при соотношении Ат/Эрит т

1, 3 0 лгглютинация нлбл><>дается в

1 лукклх, что соответствует минимальной выявляемой концентрации миоглобинл, равной 0,5 мг/мп.

Предложенный дилгностикум обеспечкзлет в 10 раз повышение чувствите;тьности определения миоглобина, умекьш; ет в 8-9 раэ время выполнеккя анализа и существенно облегчает ход выполнения анализа за счет сок, л ценил этапов опрс целeft!III йиоглобина, что важнс дчя nt уществления

-..кспресе.-диаг«ocòèêè инфаркта мт<окарда у пациентов в условиях скорой помощи и в учреждет<иях прлктическогО здрл !to oxð л нения.

Использование предлаглемого диагHocтикума обеспечивает

nc yf.tt ствления экспресс-диагностики инфаркта миокарда и пациентов в условиях скорой помощи и в у <реждениях практического здравс охрл <ения.

Ф с р м у л а и 3 о б р е т е н н я

Способ ot! I> erte>tet.лоби на пуTE ì использования с:с.«с.пс; «иэировакних формалиниэировак><ь

;>,,<П,<ПП Злклз 4335 тираж 5 I <3

1!оп< и .«