Способ получения рекомбинантной плазмидной днк,кодирующей гормон роста крысы или человека
Изобретение относится к области генетической инженерии и касается способа получения плазмидной ДНК, кодирующей гормон роста крысы или человека . Способ заключается в выделении мРНК из гипофиза, удвоении полученной РНК, получении однДНК с помощью обратной транскриптазы, удвоении полученной кДНК, отборе нужной фракции днДНК и ее клонировании в pBR 322, 2 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
PECflYBJlHH
ОЯ,SU(ii) (5в 4 С 12. N 15/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К IlATEHTV
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2996902/28-13 (62) 2620106/28-13 (22) 23.10.80 (23) 26.05.78 (31 ) 897710 (32) 19.04.78 (33) US (46) 07.11.88. Бюл. 41 (71) Дзе Риджентс оф дзе Юниверсити оф Калифорния (72) Вильям Дж. Раттер, Говард Майкл
Гудман, Джон Митчелл Чергвин (US), Аксель Ульрих, Питер Хорст Зеебург (DE) Джон Пайн (AT). и Рэймонд Луис
Пиктет (US) (53) 575.224.2:577.2(048)(088,8) (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ
ПЛАЗМИДНОЙ ДНК, КОДИРУ10ЩЕЙ ГОРМОН
РОСТА КРЫСЫ ИЛИ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к области генетической инженерии и касается способа получения плазмидной ДНК, кодирующей гормон роста крысы или человека. Способ заключается в выделении MPHK иэ гипофиэа, удвоении полученной РНК, получении однДНК с помощью обратной транскриптазы, удвоении полученной кДНК, отборе нужной фракции днДНК и ее клонировании в @BR 322, 2 табл.
1436887
Изобретение относится к генетической инженерии и касается способа получения плаэмидной ДНК, кодирующей гормон роста крысы или человека.
Способ заключается в выделении мРНК иэ гипофиза, удвоении полученной
РНК, получение однДНК с помощью обратной транскриптаэы, удвоение полученной ДНК, отбор нужной фракции
10 днДНК и ее клонированию в pBR 322.
Пример 1. Культивируемые клетки гипофиэа крысы (подклон семейства клеток GH-1), полученные иэ Американской коллекции типовых культур, используются в качестве источника мРНК для синтеза гормона роста крысы.
В этих клетках, если рост осуществляется в нормальных условиях, мРНК гормона роста содержится в небольших ко- 20 личествах, от 1 до З от общего содержания РНК, имеющей поли — A. Однако, содержание мРНК гормона роста значительно увеличивается по сравнению с содержанием других мРНК клеток в 25 результате стимулирующего действия тироидных гормонов и глюкокортикоидов . РНК выделяют из 5 10 клеток, в выращиваемых в суспенэии, в которую с целью получения гормона роста за 4 30 дня до сбора клеток добавляют I ммоль деэоксиметазона и 1О ммоль L-трийодтирона. Полиаденилированную РНК выделяют из цитоплазменных разделяющих мембран культивируемых клеток известными способами.
Полиаденилированную РНК выделяют при помощи хроматографического анали- за всего препарата PHK на олиго(дТ)целлюлозе. 40
Обратная транскриптаза, выделенная из вируса avian myeloblastosis, была получена от докт. Д.Дж,Берда, фирма
Лайф Сайенс Инк., Саик-Петербург, Флорида; ее используют дпя того, что- 45 бы скопировать полную молекулу полиаденилированной РНК, полученную иэ культивируемых клеток в кДНК. Реакции осуществляют в растворе 50 ммоль трисНС1, рН 8» 9 ммоль, MgC1 . 30 ммоль хлорида натрия, 20 ммоль бета-меркаптоэтанола, 1 ммоль каждоro из трех нерадиоактивных деоксирибонуклеозид трифосфатов, 250 ммоль четвертого деоксинуклеозид трифосфата, меченого
32Р в альфа-позиции, с удельной радиоактивностью 50-200 Ки/моль 20 мкГ/мл олиго д Т 12-18, полученного от фирмы оллаборатив Рисерч, Вальтман, Массачузетс, 100 мг/мл полиаденилиронанной
РНК и 200 ед./мл обратной транскрипо тазы, Смесь инкубируют при 45 С в течение 50 мин ° После добавления ЭДТКБаz, 25 ммоль, раствор экстра гируют при помощи насыщенного водой фенола, далее водяной слой подвергают хроматографии на Sephadex 0-100, с колонной диаметром 0„3 см и высотой 10 см, в смеси 10 ммоль трис-НС1, рН 9,0, 100 ммоль хлорида натрия, 2 ммоль
ЭДТК, Нуклеиновую кислоту, элюированную в пустой объем, осаждают при помо" щи этанола после добавления ацетата аммония до 0,25 м, рН 6,0. Осадок собирают при помощи центрифугирования, полученную таблетку растворяют в
50 мл свежеприготовленного О,1 M раствора гидрата окиси натрия и инкубируо ют при 70 С в течение 20 мин с целью гидролиза РНК. Смесь нейтрализуют с добавлением 1М раствора ацетата натрия, рН 4,5, а полученную 32 P-кДНК осаждают при помощи этанола, а затем вновь растворяют в воде. Отдельные порции кДНК, состоящей из одной нити, анализируют на натуральных полиакриламидных гелях, Гели сушат, кДНК меченую 32Р, анализируют при помощи авторадиографии с использованием пленки Kodax No-Screen-2T (фирменная марка, фирма Истиэн Кодак Корпорейшн, Рочестер, Нью-Йорк). После разделения при помощи электрофореза на геле обнаруживают слабую полосу поглощения, соответствующую ДНК с примерно 800 п.о.
Полученную кДНК, состоящую иэ одной нити, обрабатывают обратной транскриптаэой с целью синтеза комплементарной нити, Реакционная смесь содержит 50 ммоль трис-НС1, рН 8,3, 9 ммоль МяС1, 10 ммоль дитиотрейтола, 50 ммоль трех немеченмх деоксирибонуклеоэид трифосфатов, 1 ммоль меченого 32Р в позиции альфа нуклеозид трифосфата с удельной радиоактивностью 1 †Ки/ммоль 50 мкгlмл кДНК и 220 ед./мл обратной транскриптазы. Реакционную смесь инкубио руют при 45 С в течение 120 мин.
Реакцию прерывают добавлением ЗДТКИа до 25 ммоль, экстрагируют фенолом и подвергают хроматографическому анализу на Sephadex 0-100, а затем осаждают зтанолом. Порции продукта реакции с показателем от 500 отсчетов в минуту до 100 отсчетов в минуту анализируют при помощи
3 143688 электрофореза на геле. При помощи сравнения со стандартными образцами устанавливаит, что полоса поглощения гетеродисперсоида сосредоточена вокруг 800 нуклеотидов по длине, Обработка полной кДНК, на которой скопирована структура мРНК клетки гипофиза крысы, эндонуклеазой Нйа Х приводит к образовании двух основных фрагментов ДНК, причем один содержит примерно 320 нуклеотидов (фрагмент
А), а второй 240 нуклеотидов (фрагмент В). Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов А и В проводят как выше было описано Maxam
and Gilbert, что подтверждает следующйй факт: эти фрагменты являются в действительности теми частями, на которых содержится генетический код, кодирующий синтез гормона роста крысы.
При расщеплении днкДНК, содержащей 800 п.о. эндонуклеазой Hha I,ñðåди основных продуктов рассечения об- 25 наруживают два фрагмента, соответствующие по длине фрагментам А и В.
Так как кДНК, контролирующую синтез гормона роста крысы, содержащую приблизительно 800 п.о., подвергают Э0 очистке перед обработкой эндонуклеазой Hha I ДНК необходимо подвергнуть обработке с тем, чтобы удалить все несоединенные концы. В реальных условиях обработку с целью удаления та35 ких непарных концов проводят перед стадией разделения на электрофорезе в смеси, содержащей 25 мкл 60 ммоль трис-HCl, рН 7,5, 8 ммоль хлорида магния, 10 ммоль бета-меркаптоэтано- 4О ла, 1 ммоль АТФ и 200 ммоль каждого из МАТФ, d!,ÒÔ, йГТФ и 6ТТФ. Смесь инкубируют с полимеразой I ДНК (1 ед.), выделенной из штамма Е, coli npu
10 С в течение 10 мин с тем, чтобы 4 экзонуклеаолитическим способом удалить все выступающие 3 -концы и за7 полнить все 5 — выступающие концы, Полимераза I ДНК производится фирмой
Боехрингер-Маннгейм Биокемикалз, Индианаполис, Индиана, кДНК, контролирующую синтез гормона роста крысы и содержащую приблизительно 800 п.о., обрабатывают при помощи добавления химически синтезированного линкера Hind III
Полученный в результате реакции продукт, молекула которого состоит из двух нитей, с концентрацией 2-5 мкг/мл
7 .. 4. обрабатывают 30 ед. нуклеазы HI, имеющей активность 1200 ед./мл, которая была получена от фирмы Майлс Лабораториз, Элкхарт. Индиана, в смеси, содержащей 0,03 ммоль ацетата натрия, рН 4,6, 0,3 ммоль хлорида натрия, 4,5 ммоль хлорида цинка, при 22 С в течение 30 мин, а затем инкубируют о еще в течение 15 мин при 10 С. С целью прекращения ферментной реакции в смесь добавляют трис-основание с конечной концентрацией 0,1 ммоль ЭДТК до 25 смоль и тДНК.
После экстрагирования этанолом реакционной смеси и хроматографического анализа íà Sephadex G-100, 32 ркДНК, элюированную в пустой объем, осаждают при помощи этанола. В результате такой обработки обеспечивается высокий выход молекул кДНК, концы которой связаны основанием. ЛинКер Hind III лигируют с кДНК осущесто вляют при помощи инкубации при 14 С в смеси 66 ммоль трис-НС1 рН 7,6, 6,6 ммоль хлорида магния, 1 ммоль
АТФ, 10 ммоль дитиотрейтола, 3 ммоль декамера Hind III с показателем 10
S отсчетов в 1 мин/мол и лигазы ДНК Т4, приблизительно 500 ед./мл, в течение
1 ч. Чтобы дезактивировать лигазу, о реакционную смесь нагревают до 65 С; которуи поддерживают в течение 5 мин.
Предварительно к ферментам, содержащим 150 ед./мл Нзы Т или Hi Ы ТТ? добавляют КС1 с конечной концентрацией 50 ммоль, бета-меркаптоэтанол с конечной концентрацией 1 ммаль и
ЭДТК с конечной концентрацией
0,1 ммоль. Смесь выдерживают в течео ние 2 ч при 37 С. Эндонуклеазы
Hind III u Hal III производятся фирмой Ньи-Инглэнд Био-Дэбо, Беверли, Массачузест. Продукт реакции анализирунт при помощи электрофореза на геле в соответствии с примером; при этом обнаруживают пик, соответствующий последовательности приблизительно 450 нуклеотидов, наряду с отдельными фрагментами рассеченного декамера Hind III. Плазмиду pHR-322, содержащую ген, контролирующий устойчивость к ампицилину и единственное место узнавания для фермента Hind ТТТ, расположенное внутри вышеупомянутого гена, рассекают в месте узнавания для Н пй III эндонуклеазой Hsu I, затем обрабатывают щелочным фосфатом типа ВАР! фирма Уортингтон Биокемикал
5 14368
Корпорейшн, Фрихольд, Нью-Джерси.Фермент находится в реакционной смеси с концентрацией 0,1 ед. микрограмм ДНК; реакционную смесь инкубируют в 25 ммоль5 трис-HCl при рН 8 в течение 30 мин при 65 С, затем, чтобы удалить фосфатазу, производят экстрагирование в феноле. После обработки фосфатазой плазмидную ДНК разрезают Hind III )О эндонуклеазой и лигируют концы молеt кулы, в молярном отношении 3 моль плазмида на 1 йоль кДНК. Смесь инкубируют в смеси 66 ммоль трис-НС1, рН 7,6, 6,6 ммоль хлорида магния, 10 ммоль дйтиотрейтола и ммоль АТФ в течение 1 ч при 14 С в присутствии
50 ед./мл лигазы ДНК Т4 °
Смесь, в которой протекает лигация, добавляют непосредственно в сус- 20 пензию штамма Е. coli Х-1776. При этом клетки выращивают до удельной плотности примерно 2 10 кл./мл в
50 мл среды, содержащей: триптон
10 г/л; экстракт дрожжей 5 г/л, хло- 25 рид натрия 10 г/л, гидрат окиси натрия 2 ммоль, диаминопимеллиловая кислота IOO мкг/мл, тимин 40 мкг/мл о при 37 С. Клетки собирают при помощи обработки на центрифуге в течсние ЗО
5 мин со скоростью 5000 Л при 5 С, вновь суспендируют в 20 мл холодного раствора хлорида натрия, 10 ммоль
1 подвергают центрифугированию„ вновь ! суспендируют в 20 мл буффера трансформации, содержащем 75 ммоль СаС1р, 140 ммоль хлорида натрия и 10 ммоль трис-HCl, рН 7,5, затем смесь выдерживают в течение 5 мин на льду. Далее, клетки центрифугируют и вновь. 40 суспендируют в. буфере трансформации 0„5 мл. Трансформацию осуществляют при помощи смещения 100 мкл суспензии клеток с 50 MKH рекомбината
ДНК (1 г/мл). Смесь инкубируют при 4r
О С в течение !5 мин, затем в течение 4 мин при 29 С и, наконец, в о течение 30 мин вновь при О С. Далее, клетки переносят на растительный агар для роста в селективных условиях, Рекомбинированные колонии отбирают при помощи выращивания на питательной среде, содержащей ампицилин, если рост не обнаруживается, то на питательной среде, содержащей .тетрациклин с концентрацией 20 г/мл. Было получено 10 таких колоний клеток, каждая из которых содержит плазмиду
87 6 с приблизительно 800 п. о., молекула которой разрывается под воздействием фермента Hind III.
ДНК гармона роста крысы, содержащую 800 п,о., выделяют в препаративных количествах из рекомбинированного клона РГРК-1 и ее последовательность нуклеотидов анализируют, Последовательность мРНК, полученная из генетической последовательности, представлена в табл, 1.
Выделение мРНК, гормона роста человека ГРЧ проводят по примеру 1, только в этом случае биологическим источником материала является ткань гипофиза человека. Пять доброкачественных гипофизов человека, быстро замороженных в жидком азоте после хирургического удаления, вес которых составляет от 0,4 до 1,5 г каждый, оттаивают и тонко измельчают в 4М раствора гуанидин тиоционата, содержащем
1М буферный раствор меркаптоэтанола, рН 5,0, при 4 С. Гомогенат наслаивают на 1,2 мл 5,7-молярного раствора хлорида цезия, содержащего 100 ммоль
ЭДТК и центрифугируют в течение 18 ч со скоростью 37000 об/мин на ультра центрифуге Бекман с ротором типа SN
50.1 (фирма Бекман Инструмент Компани, Фуллертон, Калифорния). При этом
РНК собирают на дне пробирки, Далее, проводят очистку с использованием колонны на олиго-дТ и осаждения при помощи градиентного раствора сахарозы в соответствии с примером. Примерно
107, выделенной таким образом PHK содержит генетический код для синтеза гормона роста, этот факт устанавливается введением радиоактивного предшествующего соединения, содержащего аминокислоты, в гормон, подавляющий рост, который выпадает в осадок в системе клеток, в которых не происходила трансляция, полученных из эмбриона пшеницы.
Получение кДНК гормона роста человека проводят в соответствии с примером 1. кДНК гормона роста фракционируют при помощи электрофореза на геле и материал, который перемещают в положение, соответствующее примерно
800 нуклеотидов по длине, выбирают для размножения. Выбранную фракцию обрабатывают полимеразой I ДНК в соот7 8 ормула изобретения
Способ получения рекомбинантной азмидной ДНК, кодирующей гормон оста крысы или человека, включающий инкубирование клеток гипофиза в присутствии 1 ммоль дезоксиметазона и
10 ммоль 1-трийодтирона, отделение
РНК от цитоплазматической мембранной фракции клеток гипофиза, очисту и синтез кДНК с помощью обратной транскриптазы, инкубиройание смеси
ДНК с ДНК полимеразой в присутствии
ТФ, йГТФ, 6ЦТФ и dT73 при рН 7,5 и о.
10 С, выделение фракции кднДНК, имеюей 800 п.о,, добавление линкеров
find Ш к выделенной днДНК, смешивае днДНК с ДНК, полученной из плазмиды рВН 322, предварительно обработанной Н1пй Ш и щелочной фосатазой при рН 8,0 и 65 С в течение
30 мин с последующим инкубированием о смеси в течение 1 ч при 14 и рН 7,6 присутствии АТФ и ДНК лигазы и зкстракцией полученной рекомбинантной ДНК.
7 143688 ветствии с примером 1, затем обраба- Ф тывают с целью объединения концов линкером Hind III. Далее, кДНК рекомби- пл нируют с плазмидой рВВ-322, которую предварительно обрабатывают щелочной фосфатазой в присутствии ДНК лигазы.
Е. coli Х-1776 трансформируют рекомбинантной ДНК, а затем штамм, содер- м жащий ДНК гормона роста, извлекают.
Штамм, содержащий ДНК гормона роста, выращивают в препаративных количест. вах, иэ него выделяют ДНК гормона к роста, а затем определяют последова- дА тельность нуклеотидов. Было установлено, что выделенная ДНК гормона рос- щ та содержит нуклеотиды, содержащие 1 информацию для синтеза полной после- ни довательности аминокислот гормона роста человека. Первые 23 аминокисло- 2О ты гормона роста имеют. вид: Н N-ФЕ- ф
Про-Тр-Тле-Про-Леу-Сер-Арг-Леу-ФеАсп-Аск-Ала-Иет-Леу-Арг-Ала-Хис-АргЛеу-Хис-Глю-Леу. Остаток последова- в тельности представлен в табл. 2, 25
1436887
a u
ЛЬ И
Gg о ди
Е» О
Cl (. > ай ми жи
ЛЬ
go - О
go р,о а О а
,й
u c ео, -ч
О ь ь so ъФ ци
Аа о а о хи
Я b .Р О
Я ео
1 ь
ar u
q o
Ьь еи ю- Е» н «
C О
3.1
ЛВ н
k u еи
tO Е4 и и
Ы Е»
g,u еи
И Е-» ои
«Ц ь о с> еg» ро <, ъ и » <
L> Ю
Р и
-С О
А -1
О я ь, ьй
i,o
Ф «
41
ИЫ Я г. о
Ш « уи
ЛЬ с", и со
Й о в О
Б е j4 k g ди 1
Я
go . Ь а3 1;-» ди
«,о 8
ыо о ди (цо ео ц «
Ю (б Ц о и
Йй э .
I ао
О ь и ю
С4 с»
-Ои о г-(Я
« О ь ь
Л1 с О р о
ЛЬ р,о
И ь
Я < ь ю й
4 % е и
yo ge д йод о рр уи ь u Лй в ь. о ею г4«
tQ ОО « еи и
go дВ
Rp>
go 8
ЙВ
ЯЕ уо
5V р о и и Ь B
b0 «
3 й
ыо ь
О С ф
su и
Е- « о ои чР о
38 т
6
D о о
8 и о о
b
Ь
g с3
C и
Е» м«)
eo,! .СД 1
al g г ЬД ьо о
Й Й о еь и
CD Ц !
- Ч .и1
4 и
mo ь е» о
o a е»
CG з(5 Ю
;-; 1 о
»и и
