Способ подготовки бактерий еsснеriснiа coli,несущих рекомбинантные плазмиды,для низкотемпературной консервации

 

Изобретение относится к микробиологии , в частности к способам подготовки бактерий, содержащих рекомбинантные плазмиды, к низкотемпературной консервации, и может быть использовано в микробиологической промышленнос ти, а также в молекулярной генетике с целью длительного хранения микробных культур без потери ими жиз- / неспособности и генетической стабильности . Целью изобретения является упрощение процесса, а также расширение спектра микробных культур, подлежащих хранению, при обеспечении их оптимальной жизнеспособности и генетической стабильности. Способ заклю чается в том, что бактерии Escheri- chia coli, несущие рекомбинантные плазмиды, выращивают в жидкой питательной среде до стационарной фазы роста, готовят суспензию клеток плотностью 10-10 клеток/мл, добавляют в нее 10%-ный раствор глицерина в качестве криопротектора и 10%-ное обез- g жиренное молоко /реактив фирмы Difco) в соотношении 1:1, перемешивают и . охлаждают при температуре 4 - 6 С в течение 4-8 ч, после чего наносят на гранулы обезвоженного силйкагеля S с последующим подсушиванием при 4-6 Ci в течение 12-13 ч.в присутствии погло| тителя влаги, а затем гранулы помещают в герметически закрывающиеся ам-| пулы. Предлагаемый способ обеспечивает высокий уровень жизнеспособности культур в процессе хранения, позволяет хранить клоны е любыми типами вставок , при этом сохраняются селективные маркеры устойчивости к антибиотикам , а также сайты рестрикции. СО

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЬ ИЗОБРКтЬНиЯ

И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4253163/31-13 (22) 03. 04. 87 (46) 07. 12.88. Бюл. Р 45 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР и Всесоюзный научный центр психического здоровья

AMH СССР (72) Л.В.Калакуцкий, Т.M.Ñèäÿêèía и В,Е,Голимбет (53) 557. 15(088.8) (56) Tanaka Ioshinori et al. Appl.

and Environ Microbiol. 1979,. 37, Nl 3, р. 369-372.

Aschwood-Smith M.I. Presavation

of microorganismus by freesing, freese-drying and desiccation, Low

temperature preservation in medicine

and biology ° /Ed.by.M,Aschwood.-Smith

and 3.Parrant, Pitman Press, London, 1980, р. 2t9-252. (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ БАКТЕРИЙ

ESCHERICHIA C0LI, НЕСУЩИХ РЕКОИБИНАНТНЫЕ ПЛАЗМИДЫ, ДЛЯ НИЗКОТЕИПЕРАТУРНОЙ КОНСЕРВАЦИИ (57) Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам подготовки бактерий, содержащих рекомбинантные плаэмиды, к низкотемпературной консервации, и может быть использовано в микробиологической промышленности, а также в молекулярной генетике с целью длительного хранения

„.,зи„„и42щ a < (5D 4 С 12 N 1/04//(С 12 N 1/04, С 12 R 1:19) микробных культур без потери ими жиз- . неспособности и генетической стабильности. Целью изобретения является упрощение процесса, а также расширение спектра микробных культур, подлежащих хранению, при обеспечении их оптимальной жизнеспособности и генетической стабильности. Способ заклю" чается в том, что бактерии Escherichia coli, несущие рекомбинантные плазмиды, выращивают в жидкой питательной среде до стационарной фазы роста, готовят суспензию клеток плотностью t0 -10 клеток/мл, добавляют

8 9 в нее 10%-ный раствор глицерина в каС2 честве криопротектора и 10%-ное обез- <о жиренное молоко /реактив фирмы Difco) в соотношении 1: 1, перемешивают и . 1ф) о охлаждают при температуре 4 — 6 С в течение 4-8 ч, после чего наносят на гранулы обезвоженного силйкагеля о с последующим подсушиванием при 4-6 С в течение 12-13 ч.в присутствии погло тителя влаги, а затеи гранулы помещают в герметически закрывающиеся ампулы. Предлагаемый способ обеспечивает высокий уровень жизнеспособности культур в процессе хранения, позволяет хранить клоны е любыми типами вста вок, при этом сохраняются селективные маркеры устойчивости к антибиотикам, а также сайты рестрикции.

1442544

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам подготовки бактерий Е.coli, в т.ч. содержащих рекомбинатные плазмиды, к низкотемпературной конвервации, и может быть использовано в микробиологической промышленности, а также в молекулярной генетике с целью длительного хранения микробных культур беэ потери ими жизнеспособности и генетической стабильности.

Целью изебретения является упрощение и удешевление процесса, 15

Способ заключается в следующем.

Микробную культуру высевают на скошенный агар, в пробирку с которым вносят примерно 0,2 мл жидкой питательной среды, и выращивают до ста- 20 ционарной фазы роста. Затем к полученной суспензии добавляют 107-ный раствор глицерина и свежую питательную среду (в соотношении 1:1) до достижения плотности суспензии 10. — 25

10 клеток/мл (контроль по стандарту мутности), после чего в суспензию вносят 10Х-ное обезжиренные молоко (реактив фирмы Difсо) в соотношении

1:1 и перемешивают. Суспензию охлаж- 30 дают в холодильнике при 4-6 С в течение 4-8 ч, а затем в малой чашке Петри наносят на стерильные гранулы обезвоженного силикагеля (марка КСМГ).

Гранулы подсушивают в эксикаторе над поглотителем влаги (силикагель, хлористый кальций, пятиокись фосфора) при 4-6 С в течение 12-13 ч. В пластмассовую стерильную ампулу помещают на дно несколько зерен прокаленного индикатора влажности (силикагель с хлористым кобальтом) . Индикатор влажности (синего цвета) покрывают кружком стерильной фильтровальной бумаги.

В асептических условиях гранулы сили- 45 кагеля (в количестве 10-20 шт ).из чашки Петри переносят в ампулу. Поверх гранул помещают небольшой комочек стерильной ваты, после чего завинчивают крышку ампулы до упора. Ампулы хранят в холодильнике при темпео ратурах -40, -70 С или в парах азота при -150, -170 С. По мере необходимости из ампулы в асептических условиях извлекают по одной грануле силикагеля и на чашке Петри с соответ ствующей питательной средой произво дят инокуляцию, перемещая гранулу по поверхности питательной среды. Чашку с культурой инкубируют в оптимальных условиях.

Предварительное охлаждение суспензии после добавления протекторов необходимо для адаптации клеточных мембран к последующему замораживанию и обеспечивает лучшую выживаемость культуры.

Температура 4-6 С является оптимальной, поскольку при комнатной температуре не достигается охлаждение суспензии, а при выдерживании при отрицательных температурах могут быть повреждены клетки микроорганизмов. Для охлаждения могут быть исо пользованы температуры от 0 до 8 С, однако для обеспечения указанных значений необходимы специальные условия, .о температура 4-6 С обеспечивается обычным бытовым холодильником. Время охлаждения суспензии 4-8 ч является необходимым условием осуществления способа, поскольку при выдерживании менее 4 ч не достигается достаточное охлаждение суспензии и проникновение протектора в клетки. Выдерживание более 8 ч нецелесообразно, так как при наличии того же эффекта осуществление способа займет больше времени.

Охлажденную суспензию необходимо наносить только на гранулы обезвоженного силикагеля, так как процесс регидратации происходит с выделением тепла и, если силикагель не обезвожен, клетки сохранят какое-то количество влаги и хуже перенесут замораживание. установлено, что для достижения положительного эффекта является обязательное подсушивание гранул силикагеля с нанесенной суспензией в присутствии поглотителя влаги. Использование этого приема определяется тем, что при подсушивании происходит обезвоживание клеток перед низкотемпературным хранением. Наиболее полное обезвоживание клеток достигается не менее, чем за 12 ч подсушивания. Более 13 ч клетки подсушивать нецелесообразно, поскольку эффект достигает- . ся тот же. Требования к поддержанию температуры 4-6 С те же, что и при

0 выдерживании суспензии перед нанесением на гранулы.

Помещение гранул в герметически закрывающиеся ампулы в присутствии индикатора влажности необходимо для обеспечения контроля за условиями хра14425 нения культуры в обезвоженном состоянии

Пример 1. Культуру Escherichia

coli, содержащую рекомбинатную ДНК (Pst-I — фракция тотальной ДНК чело5 века в плазмиде pBR 322) — клон pBR

13 выращивают на агаризованной среде

I-В в присутствии тетрациклина. Выращи-! ванне проводят в течение 18 ч при 10

О

37 С на скошенном агаре с добавлением среды LB, Затем к полученной суспензии добавляют 10Х-ный раствор глицерина и свежую питательную среду LB в соотношении 1:1 до достижения плотности 15 суспензии 10 клеток/мл. В суспензию .б вносят 10Х-ное обезжиренное молоко в соотношении 1:1 и перемешивают. Суспензию охлаждают в холодильнике при

4-6 С в течение 4 ч, а затем в чашке Петри наносят,на стерильные гранулы обезвоженного силикагеля. Гранулы подсушивают в эксикаторе над осушителем (хлористый кальций) при 4-6 С в течение 12 ч. В пластмассовую 25 стерильную ампулу (фирма "Нунк ) помещают на дно несколько зерен прокаленного индикатора влажности (силикагель с хлористым кобальтом), покрывают его кружком стерильной фильтровальной бумаги. В асептических условиях гранулы силикагеля (20 шт.) пе- реносят в ампулу. Поверх гранул помещают небольшой комочек стерильной ваты, после чего завинчивают крьппку ампулы до упора. Ампулы хранят при температуре -70 С. Через 28 мес хранения проводят контроль жизнеспособности клона pBR 322. Для этого в стерильных условиях извлекают гранулу

40. и перемещают ее по поверхности питательной среды (агаризованный LB) в чашке Петри, после чего чашку с культурой инкубируют в течение 24 ч при

37 С. На поверхности среды отмечают

45 рост культуры по следу перемещения гранулы, 50

Так же проводят количественный учет жизнеспособности клеток клона рВК 13. Для этого гранулу помещают в пробирки с 1 мл стерильной воды и встряхивают в течение 5 мин на приборе Vortex — ginie, после чего делают посев десорбированных клеток (100 мкл суспензии на чашку Петри). После инкубирования подсчитывают число колоний. Через 28 мес хранения выживаемость клона составляет 4, 1, при этом после лиофилизации жизнеспособность

44

4 клона была на уровне 2 ., а после криоконсервации в процессе хранения жизнеспособность потеряна.

Сохранение селективных маркеров устойчивости к антибиотикам проверяют следующим образом. В лунки репликатора помещают суспенэию, содержащую десорбированные с носителя клетки, объемом 10 мкл. Затем делают отпечатки на поверхность питательной среды в двух чашках Петри, содержащих и не содержащих антибиотик. Через 24 ч инкубирования подсчитывают число колоний, выросших на каждой иэ чашек.

Данные по числу колоний на селективной и не, селективной среде достоверно не различаются, что свидетельствует о 100Х-ном сохранении плазмиды в штамме-хозяине в процессе хранения.

Сохранение фрагмента ДНК-человека в плазмиде определяют путем электрофореэа рестриктных фрагментов, в агарозном геле. Было показано наличие фрагмента ДНК.

Пример 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1, однако выращивают клон pHS 35, содержащий рекомбинатную ДНК (Pst 1 фрагмент геномной ДНК человека), втроенную в плазмиду pKN 001 и введенную в штамм Е.coli НВ101. Суспенэию охлажо дают при 4-6 С в течение 8 ч, затем наносят на гранулы обезвоженного сиа ликагеля и подсушивают при 4-6 С в течение 13 ч, помещают в герметически закрываю! неся ампулы, которые хранят при -70 C. Жизнеспособность клона рН$ 35 через 28 мес хранения составляет 2,6Х, после лиофилизации и криоконсервации,эта величина соответственно равна 0,96 и 20Х. Гететическую стабильность клона оценивают по сохранению селективного признака устойчивости к антибиотику, кодируемому геном в составе векторной плазмиды, сохранению сайтов рестрикции

Pst-1 в рекомбинантной ДНК и исходной длины клонированного в векторе

Pst-1 фрагмента ДНК человека.

Параллельное определение титра жизнеспособных клеток на питательных средах, содержащих и не содержащих антибиотик, показывает 100Х-ное наличие маркера устойчивости к тетрациклину.

Анализ длин рестриктных .Pst-1 . фрагментов плазмидной ДНК, выделен1442544 ь

Пример 5. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но культуру Е.

coli содержащую рекомбинантную ДНК (Pst-1-фракция тотальной ДНК человека 50 в плазмиде pBR 322 — клон pBR 13), после нанесения на обезвоженный силикагель и помещения в герметически завинчивающиеся ампулы хранят в па о рах азота при температуре -150 С.

Через 1 год хранения проводят учет числа жизнеспособных клеток путем посева на плотную питательную среду.

Выживаемость клона 5,97.

55 ной после хранения колоний клона pHS

35 в агароэном геле, показывает полную идентичность структуры рекомбинантной ДНК (наличие двух сайтов рест-5 рикции Pst-1, длина векторной молекулы около 12 тыс. пар нуклеотидов и длина вставочного Pst 1 фрагмента

990 пар нуклеотидов) до и после хранения. 10

Таким образом, уровень жизнеспособности клеток при хранении на носителе хотя и ниже, чем при использовании криоконсервации, однако вполне удовлетворителен (титр клеток 10 клеток 15

/мл) для проведения любых исследований с данным клоном. При этом на хранение помещают в три раза больше образцов (в тех же единицах хранения ампулах), чем при использовайии крио- 20 консервации.

Пример 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но для хранения используют штамм E.coli HB101, несущий плазмиду pBR 325 с.маркерами устойчи- - 5 вости к антибиотикам: хлорамфениколу, ампициллину, тетрациклину, и штамм

Е.coli С600, несущий плазмиду pVC 18 с маркером устойчивости к ампициллину.

Через 1 год хранения выживаемость 30 щтаммов составляет 1007.. При высеве на селективную среду с описанными антибиотиками выживаемость культур достоверно не отличается от этого показателя, полученного при использова35 нии неселективной среды, что свидетельствует о том, что штаммы сохраняют плазмиды.

Пример 4. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но хранят штам- 40 мы Е.coli ИС1009, LE 392, NH1 НВ101, С600. Выживаемость штаммов через

1 год хранения составляет 20-50Х, что соответствует титру 10 -10 клеток/

4 S

/мл.

Пример 6. Культуры Е.coli, содержащие рекомбинантные ДНК, клон

pHS 35, готовят к консервации аналогично примеру 2, но хранение ампул осуществляют при температуре -150 С.

Жизнеспособность клона рН$ 35 через

28 мес хранения составляет 2,9/. Выбор температур хранения -70 и -150 С обусловлен возможностями использования низкотемпературных холодильников, обеспечивающих термостатирование на о уровне -70 С и биохранилищ типа ХБ0 5 с жидким азотом, где культуры микроорганизмов в пластмассовых амо пулах хранят в парах азота при -!50 С.

Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что он обеспе-, чивает высокий уровень жизнеспособности культур в процессе хранения и позволяет хранить клоны с любыми.типами вставок. Проверка генетической стабильности штаммов с рекомбинантными плазмидами показала, что в процессе хранения сохраняются селективные маркеры устойчивости к антибиотикам, а также сайты рестрикции. Кроме того, предлагаемый способ по сравнению с известными характеризуется простотой и доступностью осуществления, сокра- щением времени на подготовку образцов, экономией ампул и расширением спектра микробных культур, подлежащих хранению. формула изобретения ! Способ подготовки бактерий Escherichia coli, несущих рекомбинантные плазмиды, для низкотемпературной конI сервации,. предусматривающий выращивание их в жидкой питательной среде до стационарной фазы роста, приготовление суспенэии клеток плотностью 10—

10 клеток/мл, добавление в нее

102-ного раствора глицерина в качестве криопротектора с последующей консервацией суспенэии при низких температурах, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения и удешевления процесса, в качестве криопротектора при высушивании клеток дополнительно используют

107.-ное обезжиренное молоко, затем

О суспензию клеток охлаждают при 4-6 С в течение 4-8 ч и наносят на гранулы обезвоженного силикагеля с последующим подсушиванием в присутствии поглотителя влаги при 4-6 С в течение

Р

12-13 ч, после чего гранулы помещают в герметически закрывающиеся ампулы . а 0 и хранят при -70 С или — 150 С.