Способ получения фракции на, содержащей защитный антиген воrdетеllа реrтussis

 

Изобретение относится к медицинской промьйшенности и может быть использовано при получении коклюшной вакцины. Цель изобретения - интенсификация способа. Для получения -- фракции НА Bordetella pertu ssis культуру в одной фазе выращивают в .жидкой питательной среде известного состава , в которую дополнительно вводят метилированный или /з-циклодекстрин в концентрации 1-10 г/л. При необходимости для стимуляции роста в среду вводят 0,1-20 г/л казаминокислот, 0,01-1 г/л аскорбиновой кислоты и 0,1-5 г/л глютатиона. Процесс культивирования ведут при 20-31°С в условиях аэрации и перемешивания, обеспечивающих концентрацию кислорода 1,0-5,5 ррт и пеногашение. Отбор культуральной жидкости для выделения целевого продукта осуществляют на стадии от -логарифмической фазы роста до статической, 4 табл. О)

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К IlATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР пО делАм изоБРетений и ОтнРытий (2 i ) 3728854/28-13 (22) 29.03.84 (31) 54680/83 (32) 30.03.83 (33) JP (46) 23.12.88. Бюл. 9 47 (71) Джуридикал фаундейшн дзе Кемосеро-терапевтик рисерч институт и Тейдзин Ль мнтед (ЗР) (72) Акихиро Гиннага, Хироси Коба, Син Сакума, Хисаси Китагава, Акира

Ямада и Едзи Сузуки (Л ) (53) 576.8.097 (088.8) (56) Патент СССР В 1384206, кл. С 12 N 1/20 // (С 12 Н 1/20, С 12 В 1/01) . 15 ° 10 82 ° (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАКЦИИ НА

СОДЕРЖАЩЕЙ ЗАЩИТНЬЙ АНТИГЕН BORDETELLA PERTUSSIS (57) Изобретение относится к медицинской промышленности и может быть

„„SU„„3447266 АЗ (51)4 А 61 К 39/1 использовано при получении коклюшной вакцины. Цель изобретения — интенсификация способа. Для получения фракции НА Bordetella pertussis культуру в одной фазе выращивают в жидкой питательной среде известного состава, в которую дополнительно вводят метилированный 4- или р-циклодекстрин в концентрации 1-10 г/л. При необходимости для стимуляции роста в среду вводят 0 1-20 г/л казаминокислот, 0 01-1 г/л аскорбиновой кислоты и

0 1-5 г/л глютатиона. Процесс культивирования ведут при 20-37 С в условиях аэрации и перемешивания, обеспечивающих концентрацию кислорода

i,0-5,5 ppm и пеногашение. Отбор культуральной щдкости для выделения целевого продукта осуществляют на стадии от -логарифмической фазы роста до статической, 4 табл.

1447266

Изобретение относится к медицинской промьппленности и может быть использовано при получении коклюшной вакцины, 5

Цель изобретения — интенсификация способа.

Пример 1. В ферментер объемом 50 л загружают 35 л модифицированной питательной среды, 1О содержащей глутамат натрия

10,72 г/л, 1-пролин 0,240 г/л, фосфат калия 0,5 г/л, хлорид калия

0,2 г/л, хлорид магния О, 1 г/л, хлорид. кальция 0,02 г/л, трисгидро- 15 ксиметиламинометан 6,1 г/л, казаминокислоты 10,0 г/л, рН 7,3 (основная среда). Стерилизуют при 121 С

6 в течение 30 мин.

Отдельно готовят дополнительную жидкость, содержащую 1-цистеин гидрохлорид 0,04 г/л, сульфат железа

0,01 г/л, аскорбиновую кислоту /

0,4 г/л, ниацин 0,004 г/л, глютатион (восстановленный тип) 0,15 г/л., Эту среду стерилизуют с помощью мембранной фильтрации. Основную и дополнительную среды смешивают перед использованием. Стерильный метилированный р-циклодекстрин добавляют в конечной концентрации 1,0 г/л.

После инокулирования B,pertussis

1 фазы в количестве 1 10 микр.тел среду культивируют при аэрации через дно реактора с помощью барботера с механичсским обеспечиванием при

35 С, рН 7,2, в течение 24 ч при различном количестве растворенного кислорода (ДО) °

IIoBbIIIleHHbIH рост микроорганизмов и интенсивное продуцирование фракции НА наблюдается в диапазоне до

0,7-6,0 ppIII особенно при 1,0-5,5 ррш.

К культуральной жидкости или к жидкой фазе культуральной жидкости добавляют сульфат аммония до степени

1/3 насьпцения. Осадок отделяют центрифугированием или фильтрованием.

Осадок растворяют в фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем f моль NaC1. К

50 раствору добавляют сульфат аммония до степени 1/2 насьпцения, осадок отделяют центрифугированием или фильтрованием, диализуют против фосфатного буфера. Полученный раствор ультрацентрифугируют, верхний слой жидкости центрифугируют в градиенте плотности сахарозы и отделяют верхний слой жидкости (фракции HA В,pertussis). Выделение осуществляют предпочтительно при 4 С и ниже. Полуо ченная фракция НА содержит большое количество LPF-HA u F-HA.

Фракцию HA разбавляют солевьпч раствором до 2-3-кратного разбавления и добавляют формалин в концентрации от 0,1 до 1,2 об,7, Смесь обрабатывают при 20-43 С в течение 3-60 дней..

LPF активность и активность HSF (гистамин-чувствительный фактор) уменьшаются и получают нетоксичную фракциюе

В сравнительных примерах 1-10 и примерах 2-5 проводят сравнение по.лучения фракции НА В.pertussis в различных условиях культивирования (при постоянной аэрации и скорости перемешивания и при переменной аэрации и перемешивании).

В ферментер емкостью 14 л загружс— ют 10 л среды (по примеру 1) и BHG кулируют культуру в количестве

1 10 микр.тел/мл. Культивируют при аэрации и перемешивании при 35 С в течение 36 ч.

Влияние условий аэрации и перемешивания на интенсивность роста культуры В.pertussis 1 фазы и выход целевого продукта представлены в табл.1.

В сравнительных примерах 1-5 7 и 8 культивирование осуществляют при постоянных аэрации и перемешивании беэ пеногашения и в этом ряду примеров условия культивирования в сравнительном примере 5 (скорость перемешивания 100 об/мнн, аэрация—

0,5 УУМ) приводят к хорошему продуцированию фракции НА. Однако скорость роста быстро уменьшается и после

36 ч культивирования концентрация клеток не превышает 15 -!Оз микр.тел/мл.

В сравнительных примерах 7 и 8 культивирование. осуществляют при постоянной скорости перемешивания

500 или 600 об/мин при скорости аэрации 0,2 VVM без пеногашения. После

5-10 ч выращивания клетки либо прилипают к верхней стенке реактора, либо культура выбрасывается из реактора за счет сильного пенообразования, продуцирование HA-фракции низкое °

В сравнительном примере 10 культивирование осуществляют при контро14 лировании ДО, но без пеногашения.

В этом случае также продуцирование

НА-фракции очень низкое из-за адгезии клеток и их выброса с пеной.

В сравнительных примерах 6-9 культивирование осуществляют при постоянной скорости аэрации и перемешивании с пеногашением. Во всех случаях, в которых количество ДО на начальной стадии культивирования больше 6,0 ррш, условия, пригодные для продуцирования фракции НА, не обеспечивались.

С интенсификацией роста культура ДО уменьшается и через 36 ч его уровень снижается до 0,7 ррш, что неблагоприятно влияет на размножение клеток и продуцирование фракции НА.

В сравнительном примере 9, где осуществляют пеногашение с помощью химических веществ, через 36 ч концентрация клеток достигает

80 .10 9 микр.тел/мл, но количества

Г-На и LPF-HA составляет 128 НА/мл и 500 ЬРЕ ед./мл соответственно.

В примерах 2-5 культивирование осуществляют при контролировании ДО в диапазоне 1,6-3,5 ppm с помощью автоматического и непрерывного контроля аэрации и скорости перемешивания ДО-контролером. После 10 ч микроорганизмы росли в логарифмической фазе и после 36 ч получены высокие урожаи клеток Р-НА и LPF-НА.

Осуществление аэрации с поверхности препятствует продуцированию фракции HA.

В сравнительном примере 11 и примерах 6 и 7 проводят сравнительное культивирование по предлагаемому способу и в стандартных статических условиях. Количество инокулята

1 10 микр.тел/мл, температура 35 С.

Статическое культивирование (сравнительный пример 11), Реактор для культивирования 1,5 л, колба КОИХ; среда — модифицированная (пример 1) в количестве 0,2 л, время инкубирования 120 ч.

Культивирование под контролем (примеры 6 и 7 по изобретению). Реактор для культивирования: ферментер емкостью 300 л, среда — модифицированная (пример 1) 200 л, дополнительно содержащая 1 г/л метилированного 1-циклодекстрина (пример 6) и 1,0 г/л метилированного р-циклодекстрина (пример 7). ДО-контроль 2,2-2,4 ppm.

Пеногашение механическое с помощью

47266

4 вращающегося диска. рН-контроль: рН 7,3, время инкубирования 35 ч.

Сравнительные данные по культиви5 рованию в различных условиях приведены в табл.2i

Из табл.2 следует, что способ по.изобретению в 2-3 раза эффективнее статического культивирования по концентрации клеток, в 10 и более

pas — по уровню 3 PF-HA, время инкубации сокращается до 35 ч.

Пример 8. Фракцию НА, полученную в примере 1, разбавляют

15 физиологическим раствором до уровня концентрации протеина 30 мкг

TCAPN/ìë. К раствору добавляют формалин в концентрации 0,6 или

i,0 об.7. и смесь обрабатывают при 37 о

20 или 39 С в течение 5-21 дня, на стадии обработки формалином добавляют аминокислоты (глицин, лизин, серии, метионин, цистеин, глютамат натрия или аспарагиновая кислота в концентрации 0,25 М или смесь глицирина и серина в концентрации 0,15 М).

В течение обработки формалином аггрегируется осадок, а раствор диализуют для удаления формалина. Цео0 левой продукт контролируют на остаточную токсичность на мышах, а. после трехнедельного хранения при 37 С"на обратимую токсичность.

Пример 9. Штамм Tohama фазы 1 В ° pertussis культивируют В сре де Bordet-gen-gengon, получают посевную культуру и используют ее для инокулирования 0,4 л модифицированной среды (пример 1),, которая до40 полнительно содержит 10 мг/мл метилированного 4-циклодекстрина, в двухлитровой колбе при конечной концентрации 10 микр.тел/мл.

Инкубацию осуществляют при вра4В щательном встряхивании при 200 об/мин и при 35 С в течение 18 ч для получения посевной культуры.

Полученные культуры объединяют и инокулируют в такую же среду, как

50 было описано, в ферментер емкостью

300 л в количестве 1.10 9микр.тел/мл; культивируют в условиях аэрации и перемешивания.

Культивирование осуществляют

55 при автоматическом контроле аэрации и скорости перемешивания, поддерживая ДО в диапазоне 1,8-2,7 ррш. Температуру поддерживают на уровне

35 С, рН 7,2. Пеногашение осуществ5 1447266 6 лякп механически с помощью ротацион- 0,2 мг/мл (в расчете на алюминий), ного диска. при зтом HA-фракция адсорбируется

Через 35 ч культивирования отби- на геле, к которому добавляют рают пробу культуральной жидкости и 5 0,01 вес./об.X тимерсола. Получают измеряют концентрацию клеток очищенную убитую адсорбированную (210 10 микр.тел/мл), F-HA коклюшную вакцину. (1024 HA/Më) и 1.РГ-НА (2400 LPE ед/мл} Результаты проверки вакцины пред-.

Культуральную жидкость центрифугиру- ставлены в табл.3. ют и отделяют супернатант. К нему 10 П р и .м е р 10, К разбавленному добавляют сульфат аммония до степени раствору нетоксичной фракции HA насыщения 1/3, образующийся осадок (пример 9) добавляют дифтерийный токотделяют центрифугированием при соид (33 Lf/èë) и сто;;лнячный Y(2K10000 об/мин в течение 30 мин. Осадо: соид (5 Lf/ìJt}, к смеси добавляют растворяют в буферном растворе 15 гель гидроокиси алюминия (0,2 мг/мл (РН 7,2}, содержащем дополнительно в расчете на алюминий) для получения

1 моль NaC1, и отделяют нерастворен- адсорбированной тривакцины. К смеси ные вещества центрифугированием при добавляют 0,02 вес./об. . желатины и

10000 o6/мин в течение 30 мин. К по- О> 1 вес./об. глюкозы для стабипизалученному верхнему слою жидкости до- 20 ции препарата, а также 0,01 вес./об.X бавляют сульфат аммония до степени тимерсала в качестве фиксатора. насыщения 1/2. Получающиеся осадки Свойства полученной тривакцины отделяют центрифугированием по опи- представлены в табл.4. санной методике и повторно растьоряют в буферном растворе, диализуют

Таким образом, использование предпри 4 С и нерастворенные вещес"t3a лагаемого способа позволяет интенсиотделяют центрифугированпем и отбра- фицировать процесс получения коклюшсывают. Раствор усиленно центрифуного антигена, используемого для гируют Упернатант Це тр ФУг Руют приготовления моно- и тривакцины в градиенте плотности сахарозы (АКДС-вакцины).

10-30 (39000 об/мин в те-тение

?О мин) и затем отделяют фРакции НА, ф о р м у л а и з о б р е - е н и я

Полученные фракции НА обьединяют и стерилизуют фильтрованием через мем- Способ получения фракции НА,, собРанный фильтР. Раствор, содержащий 35 держащей защитный антиген 8ог1еГе11а

НА-фракцию, Разбавляют бУфеРным раст- регГпзз1з, включающий культивировавоРом до концентрации пРотеина ние штамма Ногс1е1е11а рег изз1з в

300 мкг ТСАР/мл. Все стадии обработ- 1 фазе в жидкой среде в присутствии ки культуральной жидкости и очистки 1-10 г/л метилированного а-öèêëoцелевого продукта осуществляют при 40 декстрина или метилированного р --цик2-4 С. лодекстрина и при необходимости O,iК полученной НА фракции добавля- 20 г/л казаминокислот, 0,01-1 г/л аскорбиновой кислоты и 0,1-5 г/л

-80 О 02 вес./об, желатины и глютатиона в.условиях перемешивания твина-,, вес. о

45 о л ченной НА

0,25 M глицина и хранят смесь в те- . при 20-37 С и отбор полученнои чение 7 дней при, месь по л

7 " 39 С С е после фракции из культуральной среды на

Ф сфатного стадии от логарифмической фазы роста хранения диализуют против îñ.àòÿîго б ф уфера р Н 7 2 дополнительно содер- до статической фазы роста, о т л ижащего 0,7 вес./об.X NaC1, и полу- ч а ю шийся тем, что, с целью бу- 5О интенсификации способа, культивироченный раствор разбавляют тем же увание и оводят в присутствии раствсренного кислорода в количестве 1,05 5 m в условиях, обеспечивающих нетоксичной НА-фракции добавляют гель, РР исключение пенообразование. гидроокиси алюминия в количестве

1447266

Таблица 1 .!

Условия

Пример

Аэрация

VV9

ПеремешиКонтроль

DO, ppm +

Полученное количество после 36 ч култивироОбеспекультивировани вание, об/мин ниваф Ф ние вания

1 !

HA/мл LPE ед/мл

1О микр. тел/мл

Сравнительный

0,05 50

0,10 100

0,50 50

0 50 300

0,50 100

0,50 100

0,20 500

0,20 600

0,20 600

О

8 4 О

1 4 О 15 16 100

Постоян- 5 ные аэрация и пе- 6

30 128 90 ремешивание 7

16 50

10 4 О

80 128 500

30 16 50

Авт +(2,5-3,5) Авт ++

Предлагаемый

Авт 100 +(2„4-2,8) 120 512 1100

100 512 1000

120 512 1100

120 1024 1300

Непрерывное ва0 50 Авт +(1,6-3 2) рьирование аэрации и пе+(2,3-2,.6) Авт Авт

Авт Авт +(1,7-1,9) ремешивания

При контролировании (+), без контролирования (-).

С химическим обеспениваюшим агентом (+), механическое обеспенивание (-).

"Авт" означает, что аэрацию и перемешивание изменяют автоматически для контроля DO.

СтатичесПоказатели культивирования кое культивирование (прототип) Сравнительный пример 11

Пример 7

Да

Концентрация клеток (10 микр.тел/мл) 85

210

210

Количество

F-НА, НА/мл

1024

1024

1024

1з0

2350

Таблица Э

Характеристика коклюшной вакцины

Результат

Содержание азота протеина, мкг/мл 8

Тест яа стерильность

Тест на устойчивость

Концентрация ионов водорода

Тест на независимость от термолабильного токсина

Прошел

Тест на токсичность (по уменьшению живого веса мьппи), ВМ3 ед/мл

Добавление метилированного e(или р-циклодекстрина

Количество

Ы PE-HA .Н РЕ ед/мл

Время до фазы стационарного роста, ч 0

Таблица 2

Интенсивное культивирование в ферментере (по изобретению) Пример 6

Стерильно

Прошел

Прошел

7,2(2,914,0) 1447266

Продолжение табл. 3

Тест на токсичность (по возрастанию лейкоцитов мыши), LP ед/мл

Тест на токсичность (по чувствительности к гистамину мыши), HS ед/мл

Пирогенный тест (общая температура 2 С) Прошел, 0,4

Содержание алюминия, мкг/мл

Содержание тимерсала, вес./об.X

О, 168

0,009

Содержание формальдегида, вес ° /об.X

0,002

Тест на независимость от аномальной токсичности;.

Прошел на мыши на гвинейской свинье

Тест на эффективность, Прошел, 1Р ед/мл 13,5

Т а блица 4

Характеристика тривак- Результат цины

Содержание азота протеина, мкг/мл

28,0

Стерильно

Тест на стерильность

Прошел

Тест на устойчивость

6,72

Тест на независимость от термолабильного токсина

Прошел

Прошел

9,3

Тест на токсичность (по уменьшению

Концентрация ионов водорода

Прошел

0,82 (0,42-1, 25)

Прошел

0,06 (0,01-0, 16) 1447266 14

Продолжение табл.4 (4,2-17,0) Прошел, 0,5

0,174

Ов0094

Ов002 токсичности:

Прошел на мьппи на кролике коклюшная вакцина

Прошел, 13,4 дифтерийный токсоид

Прошел, 48,4 столбнячный токсоид

Прошел, 44,2 живого веса мьппи), BWD ед/мл

Тест на токсичность (по увеличению лейкоцитов мьппи), LP ед/мл

Тест на токси чность (ло чувствительности к гистамину мьппи)„

HS ед/мл

Пирогенный тест (общая температура

2ьс) Содержание алюминия, мкг/мл

Содержание тимер= сала, вес./об.7

Содержание формальдегида,,вес./об.Ж

Тест на независимость от аномальной на гвинейской свинье

Тест на стерильность: на гвинейской свинье

Тест на эффективность. ед/мл:

Прошел

0,66 (0,33-1,02) Прошел

0,04 (О, 01-0, 12)