Способ определения резистентности эритроцитов

 

Изобретение относится к медицине , точнее к гематологии, к лабораторным способам вьшвления степени повреждения эритроцитов крови, предназначено для изучения физик6-хими ческого состояния консервированных эритроцитов и для клинической практики в лабораторных методах оценки состояния мембран эритроцитов при различной патологии системы крови. Цель изобретения - ускорение и повышение точточности способа. Для этого к пробе крови, стабилизированной гепарином иди цитратом натрия, добавляют изотонический р-р NaCl, центрифугируют при 3000g 5 мин. К отдельному осадку эритроцитов добавляют изотонический р-р NaCl (разведение в 100-150 /раз), делят суспензию на 2 равнее части, контрольную и опытную. Контрольная проба используется для получения гемолизированных эритроцитов (100% гемолиз ) путем добавления в суспензию 2%-го р-ра тритона Х-100. Опытную пробу получают путем добавления к суспензии эритроцитов изотонического р-ра NaCl аналогично контрольной пробе, прогревают 5{н при 48-50 С. После температурной инкубации суспензию эритроцитов центрифугируют 5 мин при 3000g собирают супернатанты, регистрируют ну их оптической плотности при А 540 нм. Так как в пробирку с контролем добавлен детергент тритон Х-100, все эритроциты гемолизировались и величину оптической плотности этого образца принимают соствет- |ствующей 100%-ному гемолизу (Д 100%). Исходя из этого, подсчитьшают % гемолиза при 48-50°С по формуле: % гемолиза (D48.)/D,oo A, где 4s-3o c величина оптической плотности опытной пробы; 100 - величина разведения проб. При величине гемолиза 5-9% определяют умеренное снижение резистентности, при гемолизе более 10% - выраженная степень снижения резистентности 3pnTpoipiTOB. «2

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 G О1 N 33/49

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

fl0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4213846/28-14 (22) 20. 03. 87 (46) 30. 03. 89. Бюл. 11 12 (71) Институт фотобиологии АН БССР и Минская областная больница-. (72) E.È.Ñëîáîæàíèíà, B.В.Савостьянов, Н.М.Козлова и E.A.×åðíèöêèé (53) 616.07 (088.8) (56) Справочник по клиническим лабораторным методам исследования/ Под ред. Е.А.Кост. М.: Медицина, 1975, с. 88. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЧ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ (57) Изобретение относится к медицине, точнее к гематологии, к лабораторным способам выявления степени повреждения эритроцитов крови, предназначено для изучения физико-химического состояния консервированных эритроцитов и для клинической прак- . тики в лабораторных методах оценки состояния мембран эритроцитов при различной патологии системы крови. Цель изобретения - ускорение и.повышение точточности способа. Для этого к пробе крови, стабилизированной гепарином иди цитратом натрия, добавляют изотонический р-р ЫаС1, центрифугируют при 3000g 5 мин. К отдельному осадку эритроцитов добавляют иэотоничес1

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии, а именно к лабораторным способам выявления степени повреждения эритроцитов крови, и может быть испопь„„Я0„„1469464 кий р-р NaCl (разведение в 100-150

;раз), делят суспенэию на 2 равные части, контрольную и опытную. Контрольная проба используется для получения гемолизированных эритроцитов (100% гемолиз) путем добавления в суспензию

2%-го р-ра тритона Х-100. Опытную пробу получают путем добавления к суспензии эритроцитов изотонического р-ра NaC1 аналогично контрольной пробе, прог .:евают 10+1 мин при

48-50 С. После температурной инкубации суспензию эритроцнтов центрнфугируют 5 мин при 3000g собирают супернатанты, регистрируют величину их оптической плотности при 1 ==

= 540 нм. Так как в пробирку с контролем добавлен цетергент тритон

X-100, все эритроциты гемолизировались и величину оптической плотности этого образца принимают соответствующей 100%-ному гемолизу (Д 100%), 1

Исходя из этого, подсчитывают % гемолиэа при 48-50 С по формуле: % гемолиэа = Ф4 -5 с 100) /П соо 4 где

Р . — величина оптической плотности опытной пробы; 100 — величина разведения проб. При величине гемолиэа 5-9% определяют умеренное снижение резистентности, при гемолиэе более 10% — выраженная степень снижения резистентности эритроцитов.

2 зовано как в научно-исследовательской работе при изучении физико-химического состояния консервированных эритроцитов, так и клинической практике в качестве лабораторного метода, 464 з

1469 позволяющего оценивать мембран эритроцитов при различной патологии системы крови, а также адекватность гемотрансфузиойной терапии.

Целью изобретения является уско"

5 рение и повышение точности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Берут 0,2-0,4 мл свежей крови, стабилизированной гепарином, либо цитратом натрия. К ней добавляют 2040 мл изотонического раствора хлористого натрия, перемешивают и затем центрифугируют при 3000g в течение

5 мин. Супернатант сливают, а к полученному осадку эритроцитов добавляют 9-12 мл изотонического раствора

NaC1 (разведение в 100-150 раз) и делят суспензию эритроцитов на 2 20 равные части: 1 (контрольная проба) используется для получения полностью гемолизированных эритроцитов {100X гемолиз) путем добавления в суспенэию 0,1 мл 2Х-ного раствора тритона 25

Х-100. Суспензия стоит 10+1 мин при, комнатной температуре; 2 (опытная проба) — к суспензии эритроцитов добавляется 0,1 мл изотонического раствора хлористого натрия, чтобы разведение эритроцитов было, как в пробирке 1, и прогревают суспензию в течение 10+1 мин при 48-:50"Ñ.

После температурной инкубации суспензию эритроцитов центрифугируют 5 мин при 3000g и собирают супернатанты.

Затем регистрируют величину оптической плотности супернатантов при длине волны 540,нм. Так как в пробирку

Р 1 бып добавлен детергент тритон

Х-100, вследствие чего все эритроциты гемолизировались, то величину оптической плотности, полученную для это-. го образца, можно принять соответствующей 100Х-ному гемолизу. Исходя из этого„ подсчитывают процент гемолиза при 48-50 С по формуле.

D err- о c 100

Процент гемолиза

1 оо где Dq . - величина оптической плот- 50 ности опытной пробы;

D«o.> — величина оптической плотности контрольной пробы;

После этого судят о резистентнос I

55 ти эритроцитов, причем при величине гемолиза 5-9% определяют умеренное снижение резистентностн, а при величине гемолиза более 10X — выражен ную степень снижения резистентности эритроцитов.

Проведенными экспериментами установлено, что степень гемолиза эритроцитов, полученных иэ крови здоровых доноров, при исследовании предлагаемым способом не превышает 2-4% а индивидуальные значения этого показателя колеблются от 0,2 до 4Х.

Пример 1. В процессе диспансерного наблюдения за больным М., страдающим врожденной микросфероци-, тарной анемией, проводили исследование степени повреждения эритроцитов крови. Для анализа брали 0,2 мл крови, стабилизированной цитратом натрия, к ним добавляли 20 мл изотонического раствора NaC1, содержимое перемешивали и затем центрифугировали 5 мин при 3000g. Супернатант сливали, а к осадку эритроцитов добавляли 9 мл изотонического раствора

NaC1 (разведение в 100 раз), делили полученную суспензию на 2 части. К одной части добавляли О, 1 мл 1%-ного раствора тритона Х-100 (100X-ный гемолиз эритроцитов) и оставляли ее при комнатной температуре. К другой части добавляли О, 1 мл изотонического раствора NaC1 и помещали ее в термостат, где t = 48 С. Выдерживали в течение 10 мин. Затем обе пробирки центрифугировали при 3000g в течение 5 мин. Супернатанты отбирали и на спектрофотомоторе регистрировали величину оптической плотности при длине волны 540 нм в пробирках

1 и 2 и по формуле определяли процент гемолиза. В данном случае исследование крови больного показало, что гемолиз эритроцитов составляет 27Х, что указывало на выраженное снижение резистентности эритроцитов, а повторное исследование крови через два месяца после проведенного лечения показало, что гемолиз равен

5,2Х, что указывало на увеличение. резистентности эритроцитов в крови больного и позволило считать патологический процесс стабилизировавшимся. Исследование крови по прототипу показало лишь визуально, что в обоих случаях сыворотка крови приобрела красноватый цвет, что свидетельствовало лишь о наличии гемолиза, но не оценивало количество его в сыворотке, т.е. не оценивало степень повреждения клеток.

5 1469464 6

Пример 2 ° Больной Б., стра- тельного общего состояния и отсутдает хронической гипопластической ствия анемического синдрома. В проанемией с гемолитическим компонентом цессе динамического дисперсного набв течение 6 лет. У больного отмечают- людения за больным простое нетрудоемся выраженные посттрансфузионные реак- кое исследование резистентности .5 цни гемолитического и негемолитичес- эритроцитов дало следующие результакого типа. Многократно при каждом ты: исследование, проведенное при поступлении в стационар определялась поступлении, — 277 гемолиза, а исосмотическая резистивность эритроци- 10 следование через 1,5 мес. — 9,07. гетов, которая всегда оказывалась молиза, что указывало на увеличение сниженной, независимо от клиническо- резистентности эритроцитов в крови

ro состояния больного, от активности больного и позволило считать патотрансфузионной терапии, логический процесс стабилизировавшимНа фоне проводимого лечения — в 15 ся. первую очередь трнсфузий отмытых Предлагаемый способ позволяет размороженных зритроцнтов, у больного быстро и точно оценить степень повнаступило ухудшение клинического сос- реждения эритроцитов в крови больнотояния, связанное с посттрансфузион-.. го и определить тактику лечения больными реакциями, что было четко под-,ного. При исследовании крови гемаI тверждено исследованием, степени пов- тологических больных предлагаемым реждения эритроцитов предлагаемым способом (при соблюдении режима, укаспособом. Для анализа брали 0,2 мл занного в формуле) наблюдалась умекрови, стабилизированной цитратом ренная или выраженная степень повнатрия, к ним добавляли 20 мл изото- 25 режедния эритроцитов. Лишь в одном нического раствора ИаС1, содержимое случае при железодефицитной анемии перемешивали и затем центрифугирова- (заболевание, при котором мембрана ли в течение 5 мин при 3000g. Супер- эритроцитов обычно не повреждается) натант сливали, а к осадку эритроци- степень гемолиза эритроцитов была в тов добавляли 10 мл изотонического Зо пределах нормы (0,83K). В то же врераствора NaC1 (разведение в 150 раз), мя исследование крови здоровых людей делили полученную суспензию на 2 час- показало, что процент гемолиза эрити. К одной части добавляли 0,1 мл троцитов не превышает 4Ж во всех слу27-ного раствора тритона Х-100 и ос- чаях. тавляли при комнатной температуре. iàêèè образом, предлагаемьй слоК друго" части добавляли 0,1 мл иэо- соб надежен, прост в исполнении, на тонического раствора NaC1 и помеща- осуществление его достаточно 40 мин. о ли ее термостат, где при t = 50 С По сравнению с прототипом для осувыдерживали 11 мин, затем обе про- ществления предлагаемого способа бирки центрифугировали при 3000g в

40 времени требуется в 10-15 раз меньтечение 5 мин. Супернатанты исследо- ше, количество образца взятого для вали при длине волны 540 нм и рассчи- анализа тоже сокращается примерно тывали процент гемолиза эритроцитов. в 20 раз, кроме этого предлагаемый

Степень гемолиза эритроцитов до способ дает количественную оценку трансфузии составляла 5Х, а после устойчивости эритроцитов. трансфузии — 13X, т.е. до трансфузии

Использование предлагаемого спосоу больного наблюдалась умеренная сте- ба в гематологии обеспечит прогнозипень повреждения эритроцитов после рование развития тяжелых осложнений трансфузии — степень повреждения ста-, при заболеваниях крови. Способ также ла выраженной. Стоит отметить, что может быть использован при апробации эти показатели определены на фоне

50 новых лекарств и при научных исслезначительной билирубинемии и выра- дованиях. Способ доступен любой научженного ретикулоцитоза, сохранявшихся ной и клинической лаборатории. на протяжении всего курса лечения. Способ позволяет определить такПример .3. Больной М., стра- тику ведения больного (количество дает врожденной микроцитарной гемо- 55 и вид трансфузионной терапии: эритролитической анемие1л. у больного посто- цитарная масса, отмытые размороженные янная билирубинемия, выраженный рети" эритроциты), конкретизировать примекулоцитоз на фоне вполне удовлетвори- нение различных других лечебных

1469464

Составитель ЛД1илина

Техред М.Дидык Корректор М.Максимишинец, Редактор К.Крупкина

° В « \ «Ф

Заказ 1355/52 Тираж 788 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР .

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óèãoðîä, ул. Гагарина, 101 мероприятий. Результаты исследования, полученные данным способом, наряду с. другими показателями помогут врачу лучше оценить клиническое состояние больного, что немаловажно, например, для оценки трудоспособности больного. .Ф о р м у л а и з о б р е т.е н..и я

Способ определения реэистентности 10 эритроцитов путем их нагревания, отличающийся тем, что с целью ускорения и повышения точности способа, получают суспензию отмытых эритроцитов, разводят в 15

100-150 раз изотоническим раствором хлористого натрия с последующим проведением нагревания- одной части сме-. си 48-50 С в течение 10+1 мин и одновременной обработкой другой части смеси 1-2Ж-ным раствором тритона

Х-100, затем полученные образцы центрифугируют, регистрируют их оптическую плотность при длине волны

540 нм, рассчитывают процент гемолизированных эритроцитов и при его величине 5-9Х определяют умеренное снижение резистентности.эритроцитов а при величине более 10X - выраженное снижение резистивности эритроцитов.