Способ получения пептидов или их кислотно-аддитивных солей

 

Изобретение касается производства пептидов, в частности пептида ф-лы I H-Tyr-X-Gly-Phe(4-NO,)-Pro-- -NH , где X D-Met или D-Met(O), или их кислотно-аддитивных солей, которые как биологически-активные не- I mecTsa могут быть использованы в медицине . Цель - создание новых более активных и менее токсичных веществ указанного класса. Синтез пептида ведут реакцией трипептида II с дипептидом III Boc-Tyr-X-GlyOH (И) и H-phe(4-N02)-Pro-Y (III), где X - указано-, Y Ш или ОСН,. ПолученГогГа - О с11 о брГоа ы Г2иа- .. koM (перевод в КН.,-группу) с последующим отщеплением защитной группы (Вое) и вьщелением целевого продукта в свободном виде или в виде кислотно-аддитивной соли. Новые пептиды обладают противодиарейной, противокашлевой и анальгетической активностями при дозах 0,02-0,03 мг/кг, 10 мг/кг и 50 мг/кг соответственно при токсичности LDjo 500 мг/кг. 1 табл,

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ДО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 2691552/23"04 (22) 23.11.78 (31) 48980/77 (32) 24. 11, 77 (33) СВ (46) 30.03. 89. Бюл. Р 12 (71) Дзе Велкам Фаундейшн Лимитед (GB) (72) Сэмюель Вилкинсон (GB) (53) 547.964 ° 4.07(088.8) (56) Шредер Э, Любке К. Пептиды. И.:

Мир, 1967, ч. I, с. 116. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ ИЛИ их кислотно-Аддитивных солей (57) Изобретение касается производства пептидов, в частности пептида ф-лы I Н-Tyr-X-Gly-Phe(4-N0>)-Pro-NH<, где X=D-Met или D-Met(0), или их кислотно-аддитивных солей, кото" рые как биологически-активные ве-, I

Изобретение относится к способу получения пептидов или их кислотноаддитивных солей — новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретения — способ получения новых производных в ряду пептидов, малотоксичных и обладающих высокой противодиарейной, противокашле вой и анальгетнческой активностью.

Приняты следующие сокращения:

DMF — диметилформамид; THP — тетрагидрофуран DCCl — дициклогекснлкарбодиимид, НОВТ вЂ” 1 -оксибензотриазол, ЩМ вЂ” N-метилморфолин, DCU,„SU„„>ego>oe А3 (51) 4 С 07 К 7/06, А 61 К 37/02 щества могут быть использованы в медицине. Цель — создание новых более активных и менее токсичных веществ указанного класса. Синтез пептида ведут реакцией трипептида II с дипептидом III Boc-Tyr-Х-GlyÎH (II) и

Н-Phe(4-NO<)-Pro-Y (III), где Х— указано; Y = NH или ОСН . Полученный пентапептид при необходимости (когда Y = OCH>$ обрабатывают аммиаком (перевод в NH<-группу) с последующим отщеплением защитной группы (Вос) и выделением целевого продукта в свободном виде или в виде кислотно-аддитивной соли. Новые пептиды обладают противодиарейной, противокашлевой и анальгетической активностями при дозах 0,02-0,03 мг/кг, 10 мг/кг и 50 мг/кг соответственно при токсичности 1Л 500 мг/кг.

1 табл.

-дициклогексилмочевина, ВОС вЂ” третичный бутилоксикарбонил.

Ьв 4

Хроматографию осуществляют в тонicoM слое силикагеля на пластинах фирмы Merc с использованием следующих систем растворителей.

2. Смесь н-бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 3:1:1.

3. Хлороформ:метанол:32%-ная уксус- ф, ная кислота 120:90:40, 4 хлороформ:

:метанол:32%-ный аммиак 120:90:40.

7. Смесь хлороформа, метанола и

32%«ного водного раствора уксусной кислоты s соотношении 120:90:5.

8. Смесь хлороформа, метанола и

0,880 аммиака в соотношении 120:90:5.

3 1470199

Высокоразрешающую жидкостную хро- смесь ацетонитрила и 0,1 М ацетата матографию проводят на колонках: аммония, рН 4,0. Скорость протока

Zor-вах С-8, 4,6 мм х 25 см, в ка- 2 мл/мин, определение при длине волчестве подвижной фазы используют

5 ны 254 нм.

Схема 1

Ф и дЮ !

НОС

Пример 1. Н-Tyr-DNet(0)-Gly-Phe(4N0>)ProNH .

ВОС-D"Иес. Gly. ONe (1).

СНА-соль ВОС-D-Иет (28,38 If) аус- 45 пендируют в этилацетате (150 мл) и смешивают полученную суспензию с раствором KHSO+ (13,5) в воде (75 мл). После полного растворения органическую фазу отделяют, дважды 50 промывают водой (2хб0 мл), высушивают над безводным И880 и концентрируют. Полученную маслянистую жидкость растворяют в тетрагидрофуране (90 мл), охлаждают раствор до -25 С и обраба-;.55 тывают N-диметилморфолином (6,66 г) и изобутилхлорформиатом (8,60 г).

Реакционную смесь перемешивают в течение 2 мин при -15 С и затем обрабатывают предварительно охлажденным до -25 С раствором Gly OMei HCl (7,53 r) и N-метилморфолина (6,06 r) в диметилформамиде (90 мл). После вы« держки в течение 2 ч при -15 C реакционную смесь переносят s ледяную баню, обрабатывают 2 И раствором

КНСОз (72 мл) и перемешивают в течение 30 мин. После этого растворитель отгоняют в вакууме, а остаток распределяют между этипацетатом (350 мл) и водой (75 мл). Органический слой затем промывают 5Х-иьин раствором лимонной кислоты (2"50 мл), 5Х-ным растраствором NaHCO > (2x50 мл) и водой (2 50 мл). Экстракт высушивают над безводным MgSO4 и упаривают досуха, после чего сухой остаток растираю с петропейным эфиром.

5 14

Выход: 18,12 г (94X от теоретич.).

Результаты тонкослойной хроматогра фии: одно пятно в 2,7,8.

Н, D-Met, Gly, ОМе НС1 (2), ВОС-D-Met.Gly. ОМе (1) (18,1 r) суспендируют в анизоле (150 мл) и обрабатывают полученную суспензию смесью N НС1 и уксусной кислоты (440 мл). Смесь перемешивают при.комнатной температуре в течение 30 мин.

Образующийся продукт осаждают путем добавления сухого эфира, отделяют его фильтрацией и тщательно промывают сухим эфиром. Полученный сырой продукт растворяют в воде (450 мл) и раствор дважды промывают эфиром для удаления остатков анизола. Водный раствор вымораживают. В результате получают 13,77 г продукта (выход 95Х от теоретич.). Результаты тонкослойной хроматографии: чистый продукт (2,7,8).

ВОС.-Tyr.D-Met.Gly..ONe (3).

ВОСТ-Tyr (16,59 r) растворяют в тетрагидрофуране (80 мл), охлаждают до -25 С и добавляют к нему N-метило, морфолин (5,96 г), а затем при быстром перемешивании иэобутилхлорформиат (7,69 r). После выдержки в течение 2 мин при — 15 С к смеси добавляют предварительно охлажденный раствор D-Met..Gly,.ONe.НС1 (13,77 г) и N-метилхлорформиата (5,42 г) в диметилформамиде (80 мл) и продолжают о, перемешивание при -15 С в течение

2,5 ч, Затем смесь помещают в ледяную баню и обрабатывают в течение

30 мин 2 М раствором КЕЕСО р (65 мл) .

Остаток, полученный после отгонки растворителей в вакууме, растворяют в смеси этилацетата (360 мл) и воды (70 мл). Органическую фазу отделяют и промывают 5Х-ным раствором лимонной кислоты (2 50 мл), 5Х-ным раствором NaHGO (2"50 мл) и водой (2 "

"50 мл). После высушивания (NgSO ) и удаления растворителя твердый остаток растирают с эфиром. В результате получают 21,16 r (81,6Х от теоретического выхода) защищенного трипептида. По данным тонкослойной хроматографии (2,7,8), полученный продукт не содержит примесей.

ВОС-Tyr.D-Net.Gly (4).

Защищенный трипептид (3) (21, 1 г) растворяют в смеси метанола (350 мл) и воды (150 мл) и проводят омыление путем обработки 2 М раствором NaOH . (55 мл). Протекание реакции контро70199 6 (, + 1,0 формамид), 7 п 1,3 формамид).

Рассчитано,Х: С 5

N 8,66.

Найдено, Х: С 52, N 8,53. (С=1, диметил(С = 1, диметил1,96, Н 6,39, 35

13, Н 6,38;

КОС-Phe(NO ) . Pro. ОГ1е (6), HOC-Phe(N0<) (31,0 г) растворяют в дкчетилформамиде (150 мл), после чего добавляют к полученному раствору 1-окси-бензотриазол (27,0 г) охо, У лаждают смесь до -5 С и затем добавляют к ней дициклогексилмочевину (20,6 г). Смесь выдерживают в течео ние 30 мин при -5 С, в течение которых к ней добавляют раствор Pro-ONe, НС1 (16,55 г) и N-метилморфолина (10,1 r) в диметилформамиде (30 мл), Реакционную смесь перемешивают в теа чение 20 ч при 5 С и затем отфильтровывают от дициклогексилмочевины.

После упаривания в вакууме получают маслянистую жидкость, которую растворяют в этилацетате (1500 мл) и про45

55 лируют с помощью тонкослойной хроматографии (7). Установлено, что реакция заканчивается через 45 мин. После окончания реакции метанбл отгоняют в вакууме, водный раствор охлаж.дают льдом и нейтрализуют i М раствором НС1 (110 мл). Выпадающий в осадок продукт отфильтровывают, промы10 вают несколько раз водой и высушивают над Р О . Выход: 20,18 r (98Х от теоретич.). Результаты тонкослойной хроматографии: одно пятно в 2,7,8.

Рассчитано,Х: С 53,73, Н 6,61, N 8,96.

С Н g(N qO„S

Найдено,l: С 53,55, Н 6,62, N 8,76.

BOG-Туr.D-Met(0). Gly (5).

Раствор ВОС-Tyr.D-Met.Gly (5,48) в метаноле (120 мл) обрабатывают двумя эквивалентами перекиси водорода (2,7 мл 29,4Х-ного раствора).

Протекание реакции контролируют с помощью высокоскоростной колоночной

25 жидкостной хроматографии. После выдержки смеси в течение 20 ч при комнатной температуре ее упаривают досуха и растирают остаток с эфиром. Выход: 5,46 г (96,5Х от теоретического). Т.пл. 186=188 С (с разложением).

1470199 (1-, — 15,7 (C=1, 6î

Рассчитано,Х: С 50,35; Н

N 11,75.

MeOH).

MeOH}.

5, 59, С, Н,N„OqC1

Найдено,Х: С 50,03, Н 5,81, N 11,45.

BOC-Tyr.D-Met (О) . Gly. Phe (NO q) . .Pro.ОМе (8).

Раствор ВОС-Tyr.D-Met(0). Gly (1,0 г) в диметилформамиде (30 мл) охлаждают до -5 С, после чего обраба- 40 тывают его 1-оксибензотриазолом (0,56 r) и дициклогексилкарбоднимидом (0,42 r). Смесь перемешивают в

I о, течение 40 мин при -5 С, затем добавляют к ней раствор Phe (NOn),Pro. 45 .ОМе.ÍÑ1 (0,74) н N- метилморфолина (0,21 г) в диметилформамиде (5 мл) и проводят реакцию сочетания при

5 С в течение 20 ч. Выпадающий осадок дициклогексилмочевины отфильтро- 5 вывают, а фильтрат концентрируют в вакууме. Сырой продукт распределяют между этилацетатом (100 мл) и водой (20 мл). Органический слой промывают 5Х-ным раствором лимонной кислоты (2»20 мл), 5Х-ным раствором NaHCOg (2 20 мл) и водой (2 20 мл), высушивают над безводным MgSO+ и упаривают, получая в результате аморфный мывают 5Х-ным раствором лимонной кислоты (2"50 мл), 5Х-ным раствором

NaHCO (2х250 мл) и полунасыщенным раствором NaC1 (2"250 мл). Органи5 ческую фазу высушивают и концентрируют до 500 мл. Выпадающий осадок дициклогексилмочевины отфильтровыва.ют, а фильтрат упаривают, получая в результате смолу, которую не идентифицируюте

Н.Phe (NO g). Pro.OMe,HC1 (7).

Защищенный дипептид (21,41 г) растворяют в этилацетате (300 мл) и охлаждают полученный раствор до

О С, после чего пропускают. через нео го сухой газообразный хлористый водород в течение 45 мин, поддерживая температуру 0 С. Затем раствор концентрируют до 50 мл и разбавляют сухим эфиром (00 мл) ° После вымораживания продукт отфильтровывают, тщательно промывают сухим эфиром и высушивают над смесью Р 0 z u NaOH.

Выход: 15,64 r (85Х от теоретич.) 25

T.пл. 145-148 С. твердый остаток, который после растирания с эфиром весит 1,0 r (62Х от теоретич. выхода). По данным тонкослойной хроматографии (2), в полученном продукте присутствует некоторое количество дициклогексилмочевины. дальнейшую очистку не проводят.

ВОС-Tyr.D-Met(0).Gly.Phe (NOq). .Pro-МН,2 (9).

Полностью защищенный пентапептид (1,0 г) растворяют в метаноле (150 мл), раствор охлаждают в смеси льда с солью и насыщают аммиаком.

После этого колбу закрывают и оставляют смесь в течение 6 дней при комнатной температуре. Затем после тщательного удаления аммиака и метанола образующийся продукт экстрагируют смесью этилацетата и эфира. Выход:

0,81, г (831 от теоретич.). .По данным тонкослойной хроматографии (7.,7,8), полученный продукт содержит некоторое количество дициклогексилмочевины и небольшое количество исходного материала. Полученный продукт используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

Н.Tyr D-Met (0}.Gly.Phe (NO ). .PrONH< (10).

BOC-Туг,Р.Met (0).Gly.Phe (NO ). .ProNHq (0,81 г) суспендируют в анизоле (14 мл) и обрабатывают суспензию одномолярной смесью НС1 и уксусной кислоты (80 мл). После выдержки реакционной смеси в течение 45 мин при комнатной температуре ее упаривают досуха и остаток растирают с эфиром. Полученный продукт подвергают очистке с помощью ионообменной хроматографии на колонке 2,5"25 см, заполненной карбоксиметилцеллюлозой.

Элюирование осуществляют при линейном градиенте 0,005-0,2 М ацетата аммония при рН 5,1 ° Выход: 0,33 г.

По данным тонкослойной и высокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии, полученный продукт не содержит примесей.

Рассчитано,Х: С 51,15; Н 6,00;

N 13,05.

С H > 1 тО з8.СН СО Н Н О

Найдено,X: С 50,83; Н 6,06, N 12,91, Rf О 53з О 13

С з Н зэк O S: t: lV+ 6,3 (C=0,2).

М = 0,32, 0,65, 0,64 .

1470199

Схема 2

Мха

VHz ин

ИН2

Приме р 2 (см. схема 2) °

ВОС-Phe (NO ).Pro.NH (11).

ИОС-Phe (NOq).PrO.OMe (6) (22,9 г) растворякт в метаноле (250 мл) и охлаждают полученный раствор льдом, после чего пропускают через него газообразный аммиак до насыщения. Затем колбу закрывают и оставляют при комнатной температуре в течение

7 дней. После этого реакционную смесь упаривают в вакууме и сырой продукт подвергают кристаллизации из этил- 35 ацетата. По данным тонкослойной и высокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии, полученный раствор не содержит примесей.

Т. пл. 176-178,5 С. 40 (c() з — 29,4 (C=1 МеОН) . (1 < 35 7 (С 1 МеОН). Рассчитано,%: С 56,16, Н 6,40;

N 13,79. —,45

С» Н, 1i >с

Найдено,%: С 55,60, H 6,33, К 14,04.

Н.Phe (NO ).Pro NH HCl (12)

ВОС-Phe (NO<), Pro.NH< (8,0 r) растворяют в смеси метанола (20 мл), изопропанола (40 мл) и этилацетат (375 мл). Полученный раствор охлаждают льдом и пропускают через него в течение часа газообразный НС1, под-55 держивая температуру-15 С.

После этого через реакционную смесь в течение 5 мин пропускают азот и разбавляют ее сухим эфиром (450 мл) . Образующийся продукт отфильтровывают, тщательно промывают эфиром и высушивают в вакууме над смесью Р„О и NaOH. Выход 6,28 г (93% от теоретич.). Т.пл. 156-159 С.

Ге ) — 13,5 (C= 1, MeOH).

Ы ) z — 15, 3 (С=1, MeOH) .

ВОС-Tyr Л-Met.Gly.Phe (NO<) .Pro.

ЛН (13). !

ВОС-Tyr.D-Met (0) . Gly (5) (1, 0 г) растворяют в диметилформамиде (20мл) и охлаждают полученный раствор до

-25ОС, после чеro к нему добавляют

N-метилморфолин (0,21 r) и изобутилхлорформиат (0,28 г) и интенсивно перемешивают смесь в течение 2 мин, поддерживая ее температуру равной о

-15 С. Затем к ней добавляют предварительно охлажденный до -25ОС раствор

Phe (NO<).Pro.NH .НС1 (0,71 г) и

N-метилморфолина (0,33 г) и перемешивают при -15 С в течение 2,5 ч.

После этого реакционную смесь переносят в ледяную баню и обрабатывают

2М КНСОз (2,5 мл) в течение 30 мин, Растворители отгоняют в вакууме,, а остаток распределяют между этилацетатом (270 мл) и водой (40 мл). Органическую фазу отделяют и промывают

5%-ным раствором лимонной кислоты (2 40 мл), 5%-ным раствором МаНСОз (2"40 мл) и водой (2х40 мл). Экстракт высушивают и упаривают досуха. Пос1470199

ED>, мг/кг

Испытуемое соединение

Соединение примера

Соединение примера 3

Морфин

О,1

0,1

0,05

50 где Х-DMet, DMet(0), ле растирания остатка с эфиром получают 0,56 r продукта (35% от теоретич. выхода). Полученный продукт используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

Н. Tyr. D-Met (О) . Gly, Phe (ИО ) .Pro. .ЫН,(14), От ВОС-ТугЛ-Met(0) .Gly.Phe (N0z)

10 .. Pro. NH z (О, 56 r) отщепляют з ащитную группу в молярной смеси НС1 и уксусной кислоты (56 мл) в присутствии анизола (20 мл). После выдержки в течение 30 мин при температуре окружающей среды реагенты удаляют в вакууме и полученный сырой продукт путем растирания остатков с эфиром.

Полученный сырой продукт. подвергают хроматографии на колонке 2,5«25 см, заполненной карбоксиметилцеллюлоэой.

Элюирование осуществляют при линейном градиенте 0,005-0,2 M ацетата аммония при рН 5,1. После такой предварительной очистки пептид снова возвращают в колонку 2 р 5р 50 см, заполненную карбоксиметилцеллюлозой и осуществляют элюирование ацетатом аммония с линейно изменяющейся концентрацией от 0,005 до 0,1 М при рН 5,1. После удаления летучего буфера с помощью проводимой несколько раз сублимационной сушки получают чистый пептид. Выход: 50 мг (91% от теоретич.}. По данным тонкослойной (2,7,8) ,и высокоскоростной колоночной жид- 35 костной хроматографии., п6лученный продукт не содержит примесей.

Рассчитано,%: С 50«52, Н 6,05,;

N 12,89.

С 1рН И,Оз8 СНэСО Н 1 р 5 Н О

Найдено,X: С 50,59, Н 5,96, N 12,97.

Пример 3. Н-Tyr-DMet-GlyРЬе(4!1О )РгоИН получают согласно схеме, укаэанной вьппе. Продукт выделяют в виде хлористоводородной соли присоединения, а затем чистят на карбоксиметилцеллюлозе (СМС 52) градиентным элюированием буферными растворами уксуснокислого аммония (0,00! И до 0,5 M). После лиофилизации из водного раствора получают уксуснокислую соль присоединения

Rf: О 52, Ор83, 0«47

Ld 2 в, +8,1, (C=0,2 MeOH).

Фармакологическая активность.

Пептиды указанных примеров испытывали на следующие виды активности с помощью стандаргных фармакологических способов.

Анальгезия в мышах при испытании горячей пластиной, причем пептид вводят посредством инъекции внутрь мозгового желудочка.

Антидиарейная активность в крысах. В этом способе крысы голодают в течение 24 ч, затем пептид вводят подкожно или орально, после чего через 15 мин дают орально касторовое масло по 1 мл на крысу (ED, - 0,020,03 мг/кг).

Для противокашлевого испытания, морских свинок подвергли воздействию аэрозоля, содержащего 20% лимонной кислоты, через 30 мин после введения соединения (орально или подкожно).

Подсчитывали число кашлей в течение пятиминутной экспозиции и усредняли значения для шести животных в опыте (ED „ - 10 мг/кг р.о.).

Анальгезия в мышах в испытании с судорогой (модификация способа

Гендерсона с сотр.) при оральном введении пептида.

Основное их назначение — лечение диареи.

При испъ|тании на крысах для синтезированных пептидов и морфина были пОлучены следующие значения ED5o (см. таблицу), характеризующие их анальгетическую активность. перорально внутривенно

Испытываемые пептиды малотоксичны - при введении их по отдельности перорально пяти мышам в количестве

500 мг/кг ни одна из мышей не умерла.

Соединения по изобретению малотоксичны, обладают высокой протнводиарейной, анальгетической и противокашлевой активностью.

Формула изобретения

Способ получения пептидов формулы

Н-Tyr-Х-Gly-Phe (4N0 <) Р ro-NH <, 13!

1470199 где У=NH

BOG-Tyr X-Gly-Phe(4NOq)-Рго7, в случае необходимости, если Y-ONe, при обработке аммиаком заменяют ОМе группу на аминогруппу, затем отщепляют защитную группу и целевой продукт выделяют в свободном виде или в виде кислотно-аддитивной cosut. или их кислотно-аддитивных солей, отличающийся тем, что трипептид формулы

ВОС-Tyr-Õ-GlyOH, где Х-DMet или DMet(0) подвергают взаимодействию с дипептидом формулы

Н-Phe(4NO<)ProY, Составитель В.Волкова

Техред М.Моргентал Корректор С,Черни редактор О. Спесивых

Заказ 1369/59

ВНИИПИ Государственного

113035, Тираж 339 Подписное комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно"издательский комбинат "Патент", r.yæãîðîä, ул. Гагарина,101