Гексапептид,обладающий антипанкреонекротической активностью
Гексапептид формулы tyr-Ala-Gly- -Phe-Leu-Arg, обладающий антипанкреонекротической активностью. со . 00 со NU со
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК
„„Я0„„1348343
А1
1, ", ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н двтореном СвидетельСтву
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3772995/23-04 (22) 16.07.84 (46) 30.10.87. Бюл. ¹ 40 (7 1) Всесоюзный кардиологический научный центр AMH СССР (72) Е.И. Чаэов, В.H. Смирнов, В.А, Виноградов, И.И. Титов, В.П. Пении, A.Ê. Гергадэе, Г.П, Титова, Ж.Д. Беспалова, Б.Л. Пекелис, Н ° К. Пермяков, С.И. Емельянов и А.А. Джикия (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Лаптев В.В, Лечение деструктивного панкреотита 5-фторурацилом,—
Хирургия, 1981, №- 1, с. 67-72. (5!)4 С 07 К 7/06 А 61 37 02 (54) ГЕКСАПЕПТИД, ОБЛАДА1ОЩИЙ АНТИПАНКР ЕО НЕ КРОТИЧЕС КОЙ АКТИВ НОС ТЫО (57) Гексапептид формулы fyr-А1а-Gly-Phe-Leu — Arg, обладающий антипанкреонекротической активностью. природы, проявляющих высокую антипанкреонекротическую активность и не вызывающих побочных реакций.
Карбобензокси-лейцил-аргинин (1).
К раствору 1,74 4г (10,00 мМ) аргинина н 25 мл лиметилформамида,добавляют 4,25 г (11,00 MM) и-нитрофенилового эфира карбобензоксиглицина, смесь размешивают при комнатной температуре в lечение суток. Диметилформамид упаривают, остаток растворяют в 5 мл метанола и добавляют 300 мл . фира. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром, сушат в вакуум-эксикаторе.
Полу или,05 г (967) продукта с т.пл. 126-130 С; R ) 0,46 (н-бутанол : y êсусная кислота : вода 4:1:5) (A); R 0,63 (и-бутанол : пироднн : уксусная кислота : вода 10,5 ь
b : 1 : 7,5) (E); R4 0,74 (н-бутаHîë : укcóñная кислота : вода 3:
1:1) (В);1с(1 = — 13 (с 1, MeOH).
Карбобснзокси-фенилаланил-лейциларгинин (,2).
Через раствор 4,05 r (9,61 мМ) (1) н 35 мл трифторуксусной кислоты в течение 1 ч пропускают ток сухого бромистого водорода. Растноритель упаринают, к остатку добавляют 150 мл эфир», выпавший осадок отфильтровывают, растворяют н воде и обрабатывают ионообменной смолой Амберлит
1РА-410 (ОН форма) до отрицательной реакции на ионы брома. Смолу отфильтровывают, промывают на фильтре метанолом, водой, фильтрат упаривают, остатки воды удаляют азеотропной перегoHKQH с изопропиловым спиртом.
Остаток растворяют в 25 мл диметилформамида, к раствору добавляют 4,44 г (10,58 мМ) и-нитрофенилоного эфира карбобензокси-фенилаланина. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение суток. Диметилформамид отгоняют, остаток растворяют в 5 мл метанола и добавляют 300 мл
Изобретение относится к новому биологически активному соединению гексапептиду формулы
Tyr-Alа — Gly-Phe-Leu-Arg, обладающему антипанкреонекротической активностью, которое может найти применение н медицине °
Цель изобретения — поиск в области химических соединений пептидной
48343 2 эфира, Выпавший осадок отфильтронывают, промывают на фильтре эфиром, сушат в вакуум-эксикаторе, Получают 4,43 r (817) продукта с т.пл. 1,33- 136 С; !с 1 = -19,3 (с 1, МсОН); R$ =- 0,71 (В); R I = 0,63 (Б); (этилацетат: R$ = 0,66 пиридин : уксусная к-та : вода 45:20:6:11) (Г).
1Р
Карбобензокси-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинин (3).
Продукт получают аналогично (2).
Исходя из 4,43 г (7,79 мМ) (2) и
2,83 r (8,57 мМ) и-нитрофенилового эфира карбобензоксиглицина получают
4,14 г (857) продукта с т.пл. 140
143 С I К = 0 48 (В); В = 0 50 (А); К = — 0,60 (Б) . 2р Карбобензокси-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинин (4), Продукт получают аналогично (2}, Исходя из 0,63 г (1,01 мМ) (3) и 0,38 г (1,11 мМ) п-нитрофенилоного эфира карбобензокси-D-аланина получают 0,56 г (797.) продукта с т.пл ° 147 — 149 С. 1 = 1э = — 4, 0 (с О, 5, ДМФА); R f — 0,33 (8); R $ = 0,67 (хлороформ Зр метанол : 327-ная уксусная к-та 60: :45:20) (D) R f = 0,35 (Г), Карбобензокси-о-бензил-тирозил-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинин (5). Продукт получают аналогично про35 дукту (2) . Исходя из 0,56 г (0,80 мМ) (4) и 0,43 r (0,88 мМ) п-нитрофенилового эфира карбобензокси-о-бензил-тирозина получают 0,64 г (847) про4р дукта с т.пл. 1„50-153 С; М p = — 8,1 (с I, ДЕФА); К = 0,41 (В); R1 = — 0,52 (Г); Rf = 0,60 (н — бутанол: пиридин : аммиак конц. : вода 20:12: :3 . 15) (Е) . Тир озил-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинин (6). 0,64 г (0,67 мМ) (5) растворяют н 20 мл уксусной кислоты с добавлением ,анизола (307 от ооъема) и гидрируют 5р н присутствии палладиевого каталйза» тора. Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре уксусной кислоты, фильтрат упаривают, остаток переосаждают из метанола (5 мл), эфиром (150 мл), сушат в вакуум-эксикаторе, Полученный продукт наносят на колон" ку (600x15) с Сефадексом 5 PC-25 и фракционируют в градиенте пиридинацетатного буфера 0,05 м — 1,00 м. 1348343 4 после чего собаки забивались внутрисердечным введением гексенала. Активность панкреатических ферментов в крови, моче и панкреатическом 5 соке измерялась в процессе развития экспериментального панкреонекроза для диагностики развивающегося заболевания до начала его лечения. После развития панкреонекроза и начала введения препаратов эти измерения проводились только в сыворотке крови, так как при прогрессирующем панкреонекроэе имеет место уменьшение диуреза вплоть до полной анурии, а также резкое уменьшение количества панкреатического сока. Таким образом, сравнительное количественное влияние различных препаратов на ферментативную активность в условиях развившего20 ся панкреонекроза возможно только в крови. Эти данные приведены в табл. 1-3. Сравнение предлагаемого гексапептида с ближайшими структурными аналогами,такими как глюкагон,соматостатин или карбазаты пептидов, нецелесообразно, так как эти препараты значительно уступают по эффективности 3О фторафуру и не нашли клинического применения при заболеваниях поджелудочной железы. з Получают 0,34 г (657) продукта с т, пл, 173-176, С; 1«! р = — 19, 1 (с 0 33, Н О); Вf = 0 55 (D), Rф = 0,54 (Б); R f = 0,41 (Е), Данные аминокислотного анализа: тирозин 1, 18 (1), алании 1, 1 7 (1) > глицил 1,15 (1), фенил-аланил 1,00 (1), лейцил 0,99 (1), аргинин 1,09 (1) . Индивидуальность полученного сое динения подтверждена спектром ЯМР, а также методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Пептид элюировался одним. пиком при 42,37 градиента на 14,9 минуте. (колонка 250 х 4,6 мм, Spherisov BODS, 5, подвижная фаза А:0,05 M КН PO), pH 3,0; В: СН CN; grad 20 — 507 В за 20 мин; давление 1500 psi, скорость 1 мл/мин, детекция при 214 мм). Проведены биологические испытания предлагаемого гексапептида, Биологическая активность предлага емого соединения была исследована в опытах на собаках на модели экспериментального острого панкреатита, ныз ванного введением желчи в вирсунгон проток. Все эксперименты проводили в состоянии животных "натощак", что необходимо для синхронизации экзокринной деятельности поджелудочной железы. Перед введением инфицированной желчи н вирсунгон проток забирали фоновые пробы крови, мочи и панкреатического сока для специальных энзимологических исследований. После введения желчи н нирсунгов проток эти же биологические пробы забирали ежечасно, до окончания эксперимента. Для диагностики развивающегося панкреатита и оценки выраженности наступающих деструктивных изменений в экзокринной ткани и энэимной токсимии исследовали активность следующих панкреатических ферментов: а-амилазы по Каравею, липазы по Найтельсону, суммарной эстеразной активности по Траушхольду и Верне, антитриптнческой активности по Пасхиной, трансамидиназы по Карелину. В контрольной группе экспериментов участвовали три собаки. Им создавали только экспериментальный панкреатит без лечения предлагаемым гексапептидом, острый опыт длился 6-8 ч, Как следует из приведенных в табл. 1 — 3 данных, предлагаемый препарат обладает существенными преимуществами перед фторафуром и контрикалом по влиянию на показатели активности ферментов н сыворотке крови н условиях развившегося панкреонекро4р за. При введении предлагаемого соединения резко снижается активность липазы, суммарная эстеразная активность крови, отмечается трехкратное повышение антитриптической актинности. Это 45 свидетельствует об уменьшении выброса в кровь активных панкреатических ферментов с параллельным нарастанием уровня их ингибиторон ° Снижение концентрации в крови фракции "средних молекул свидетельствует о падении токсемии, снижении интоксикации. При введении фторафура эти показатели практически не изменяются в то время как инфузии контрикала не предотвращают продолжающееся нарастание активности липазы в эстераз, а также уровня средних молекул в крови. Проведены морфологические исследования экэокринной ткани поджелудочной 1348343 железы при экспериментальном геморрагическом панкреонекрозе до введения предлагаемого гексапептида и пос.пе его введения, После введения инфицированной жел5 чи в вирсун гон Ilpo ToK очаговый панкреонекроз с выражеHHbIM HHTpратициальным отеком развивается в ближайшие 30 мин. Через 2 ч развивается диффузный геморрагический панкреонекроз. В ос10 нанном это внутридольковые поражения поджелудочной железы. Характерным явпяется геморрагическое пропитывание зон некроза, отек и кровоизлияния межацинарных пространстB с выраженны; ми нарушсниями в системе микрогемопиркуляторного русла — эритростаэы, агрегация форменных элементов и микротромбозы капиллярного и ненулярного звена. Макроскопически через 4-6 ч после воспроизведения панкреатита поджелудo I!Iая железа животных выглядит диффузно отечной с единичными стеатонекрозами под капсулой и множественными меж- и внутридолькоными кровоизлияниямп. :30 13 стологичеcKH рисунок допек нарушается за счет массивных доllbKoBhIX и мо заичных внутридольковых некрозов. В зонах некроза наблюдаются маспросветах таких ацинусов можно различать фрагменты некротизованных клеток и единпчгп е лейкоциты. В пограничных с некрозом зонах 40 существуют вьц аженные признаки дис— комплексации ацпнарных клеток (АК), внутриклетечные и клеточные некрозы без отграничения их ст жизнеспособIIbIx участков цитоплазмы. е В зонах некроза полностью нарушается целостность клеточных мембран, органеллы ЛК предоставляются вакуолизированными мембранными структурами, ядра находятся в состоянии пикноза или лизиса с сохранением глыбок 50 конденсированного хроматина среди клеточного детрита. Морфологические изменения экзокринной ткани поджелудочной железы при экспериментальном геморрагическом панкреонекрозе после лечения сивные меж-, внутриацинарные и мериваскудярные кровоизлияния, рисунок 35 ацинусов полностью нарушается, лишь отдельные контуры их сохраняются эа с.чст цельности базальных мембран. В предлагаемым гексапептидом показали, что на ранних сроках лечения гексапептпдом изменяется характер панкреонекроза, т.е. отсутствуют все морфологические признаки, характеризующие прогрессирование процесса, отсутcTBóKIT и острые сосудистые изменения такие как стазы, микротромбозы. Пре,обладает коагуляционный паренхимный некроз ° Сохраняется кровоток в системе микроциркуляторного русла как в неповрежденной паренхиме, так и в зонах паренхимного некроза, что особенно важно для последующей регенерации и элиминации некротически изме. ненных тканей. Сохраняются признаки нарушения дренажной функции секрета по протоковой системе, QTcóòñòâóKIT четкие признаки снижения секреторной активности неизмененной ацинарной паренхимы. Отсутствуют признаки расширения центроацинарных протоков и переполнения секретом протоков различных калибров. Подобные изменения указывают на сохранение нормальной дренажной функции протоковой системы и выброса секритируемых ферментов в просвет двенадцатиперстной кишки. Через сутки после лечения экспериментального панкреатита внутривенным введением гексапептида в поджелудочной железе сохраняется картина смешанного панкреонекроза. Через сутки после лечения отмечается положительная динамика в морфологии геморрагического панкреонекроэа. Отсутствуют признаки меж- и внутридольного отека, воспаления интеротиции. Лишь в отдельных участках, в зонах единичных стеатонекроэов, имеются выраженный демаркационный воспалительный вал и воспалительная инфильтрация, распространяющаяся на близлежащие междольковые пространства. Имеют место и ареактивные стеатонекрозы, Отсутствуют изменения в системе макро- имикрогемациркуляторного русла. Сохраняются признаки мелкоочагового геморрагического панкреонекроза. Особенностью очагов некроза является четкое отграничение их от неповрежденной паренхимы. Отсутствие некротического детрита в мелких очагах поражения или сохранение его в крупномасштабных очагах повреждения с незначительной воспалительной инфильтрацией этих зон, В отдельных очагах 1 3 !83- 3 некроза выявляются свежие кровоизлияния. Гистохимическое исследование поджелудочной железы выявило снижение секреторной активности, отсутствие 5 дистрофических изменений вне поврежденной паренхиме восстановление вы) деления секрета в протоковую систему с некоторым нарушением дренажной 10 функции крупных протоков. При лечении геморрагического панкреонекроза предлагаемым гексапептидом через 7 сут наблюдается полная организация очагов некроза в виде !5 недифференцированных эпителиальных комплексов или с началом ацинарной дифференциации. Отсутствуют признаки меж- и внутрилолькового склероза. Через 14 сут после начала лечения 20 наступает полная регенерация ацинарной ткани с компенсаторной гиперфункцией ацинарных клеток без каких-либо признаков повреждения органа и воспаления, наблюдается выраженная тенден- . g5 ция к нормализации аминолитической, липолитической и протеолитической активности поджелудочной железы. Изучение острой токсичности гексапептида было установлено что его ЛД состагляет 150 мг/кг, терапев- тическая доза его 0,3 мг/кг, т.е. превышает летальную дозу в 500 раз, Предлагаемый гексапептид не изменяет клеточный состав крови, т.е. не угн<— тает процессы кровотворения и не вызывает патологических реакций со стороны иммунной системы. Действие предлагаемого гексапептида сравнивают на той же модели остро40 го панкреатита с действием широко используемых препаратов — фторафура и контрикала менее токсичных соединений (например, ПД для фторафура 750 мг/кг), В то же время терапевти45 ческая доза последнего 5 мг/кг (ЛД р превышает терапевтическую дозу в 150 раз). При использовании фторафура Ila ранних сроках лечения сохраняется большая воспалительная инф!!льтрация зон некрозаинтерстиция. При более поздних сроках лечения масштабы некроза экзокринной ткани уменьшаются, но сохраняется массивная воспалительная инфильтрация интерстиция, отмечается появление множественных очагов жирового панкреонекроза с лейкоцитарным валом (npoIlpcc идет по типу микроабсцедирова-ния) и развитие начальных явлений склероза интерстиция. Через 7 сут после начала лечения развивается выраженный фиброз поджелудочной железы с разобщением долек на фрагменты. Регенерация поджелудочной железы неполноценная, имеет место развитие недифференцированной эпителиальной ткани. При лечении экспериментального острого панкреатита контрикалом на ранних сроках лечения наблюдается прогрессирование геморрагического некроза с геморрагической имбибицией интерстиция и зон некроза. Контрикал уменьшает нарушения внутриорганной микрогемолимфоциркуляции, в отдельных опытах снимает сосудистые тромбозы, однако животные погибают через 810 ч от начала опыта вследствие прогрессирующего некроза экзокринной паренхимы и энэимной токсемии. Таким образом, предлагаемый гексапептид при остром панкреатите эффективно угнетает синтез панкреатических ферментов, улучшает внутриорганное крово- и лимфообращение, ограничивает площадь некротических изменений экэокринной паренхимы и при повторных парентеральных введениях приводит к полной регенерации поджелудочной железы без остаточных признаков некроза и воспалительных явлений. 1348343 Таблица 1 Изменение ферментной активности и кининов в сыворотке крови при экспериментальном геморрагическом панкреонекрозе после внутривенного введения контрикала в дозе 10000 АТрЕ в час (3 собаки) Показатели после введения контрикала, через ч Показатель Активность липаэы, ед. 0,64 0,03 0,72+0,08 0,78+0,09 20, 2+О, 8 22,0+0,2 18,0+2,6 Средние молекулы в условных единицах оптической плотности 0,325+0,018 0,444+0,030 0,428+0,052 Таблица 2 Изменение ферментной активности и кининов в сыворотке крови при экспериментальном геморрагическом панкреонекрозе после внутривенного введения фторафура в дозе 5 мг/кг (3 собаки) Показатели после введения фторафура, через ч Показатель 158,0+ 18,2 0,62+0,+12 Активность липазы, ед. 0,58+0,07 0,58+0,04 0,56+0,02 22,2+1,4 20, 1+1,2 20,1+1,2 Средние молекулы в условных единицах оптической плотности 0,365+0,032 0,402+0,026 0,396+0,073 Активность альфаамилаэы, мг/ч мл Суммарная эстеразная активHocTbi мкМ/мл Антитриптическая активность, ИЕ Активность альфаамилазы, мг/ч мл Суммарная эстеразная активность, мкМ/мл Антитриптическая активность, ИЕ Показатели при развившемся панкреонекрозе 152в0 18в2 0,62+0,04 Показатели при развившемся панкреонекрозе 144, 2+16,0 2,04+0,06 152, 2+24, 1 0,48+0,02 158,0 15,3 2,26+0,81 153, 3+17, 1 0,54+0,08 12! 348343 Таблица 3 Изменение ферментной активности и кининов в сыворотке крови при экспериментальном геморрагическом панкреонекроэе после внутривенного введения предлагаемого гексапептида в дозе 0,3 мг/кг (7 собак) Показатель Показатели после введения предлагаемого гексапептида, через ч панкреонекрозе 4, 6 Активность альфаамилаэы мг/ч мл Активность липазы, ед Суммарная эстеразная активность, мкМ/мл 0,20+0,09 0,76+0,05 0,16+0,08 Антитриптическая активность, ИЕ 26, 5+1,3 78,0+3,1 72,0+2,5 Средние молекулы в условных единицах оптической плотнос0,432+0,96 0,250+0,032 0,286+0,058 ти Составитель И. Волкова Техред М.Ходанич Корректор М.Максимишинец Редактор Н. Киштулинец Тиралс 347 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по. делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35„ Раушская наб., д, 4/5 Заказ 5163/24 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 г Показатели при развившемся 178,0+28,2 1, 15+0,08 246,2+26,7 0,25+0,02 2 58, 2+ 3.3, 2 0,40+0,05
