Гексапептидамид, обладающий пролонгированной гипертензивной активностью

 

Изобретение касается производных пептидов, в частности гексапептида (ГПА) формулы D-Ala-D-Ala-L-Tur-D-Ala-Glu-L-Phe- NH₂, обладающего пролонгированной гипертензивной активностью, который поэтому может найти применение в биологии. Цель создание активных производных пептидов. Синтез ГПА ведут в условиях твердофазного метода постепенного наращивания петидной цепи, исходя из трет-бутилоксикарбонил- L-Phe, присоединенного к полимерному носителю сефадексу-Lh-20. Испытания показывают, что ГПА малотоксично (ЛД₅₀= 1310 мг/кг) и обладает более длительным гипертензивным действием, чем например, ангиотензин П ( в 22 раза), при полном отсутствии побочных явлений, причем эффект проявляется при внутривенном введении, тогда как у известного только при введении в определенные участки головного мозга. 1 табл.

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям гексапептидамидам, обладающим пролонгированной гипертензивной активностью, которые могут найти применение в биологии. Цель изобретения новые производные пептидов: малотоксичные, обладающие пролонгированной гипертензивной активностью, не вызывающие побочных эффектов и пригодные для внутривенного применения. П р и м е р. Синтез D-Ala-D-Ala-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-NH₂. Стадия 1. Присоединение трет-бутилоксикарбонил-L-фенилаланина к полимерному носителю сефадексу-LH-20. 1,99 г (7,5 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-L-фенилаланина и 1,34 г (8,25 ммоль) карбонилдиимидазола растворяют в 25 мл сухого диметилформамида, выдерживают 15 мин и заливают 5 г гранулированного (размер гранул 25-100 мкм) сефадекса-LH-20. Через 48 ч полимер отфильтровывают, последовательно промывают сухим диметилформамидом (2х25 мл) и диэтиловым эфиром (2х15 мл), затем сушат до постоянной массы. Выход продукта 5,62 г или 33% от теоретически рассчитанного. Стадия 2. Деблокирование полученного на первой стадии продукта. 5,62 г BOC-L-Phe-Seph, полученного на первой стадии, заливают 25 мл 1 н. раствора n-толуолсульфокислоты в ледяной уксусной кислоте и выдерживают 90 мин. Деблокирующий раствор отфильтровывают, полимерный продукт промывают 25 мл уксусной кислоты, метанолом (5х25 мл), диэтиловым эфиром (2х15 мл) и сушат. Выход продукта, представляющего собой TosOH˙L-Phe-Seph, 5,8 г. Стадия 3. Депротонирование TosOH˙L-Phe-Seph. Полимерный продукт, полученный на стадии 2, обрабатывают при перемешивании 10%-ным раствором триэтиламина в диметилформамиде (2х25 мл) в течение 1 мин каждый раз, промывают диметилформамидом (2х25 мл), метанолом (2х25 мл), диэтиловым эфиром (2х15 мл). Объединенный фильтрат упаривают на роторном испарителе, сухую триэтиламмониевую соль n-толуолсульфокислоты растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. По оптической плотности раствора, измеренной на спектрофотометре при λ 260 нм, с использованием градуировочной кривой определяют количество свободных аминогрупп, равное 2,5 ммоль. Таким образом, выход L-Phe-Seph равно 5,37 г. Стадия 4. Ацилирование L-Phe-Seph действием BOC-Gly. Ацилирование проводят методом симметричных ангидридов. 2,63 г (15,0 ммоль трет-бутилоксикарбонилглицина растворяют в 15 мл безводного диметилформамида и добавляют раствор 1,55 г (75 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл диметилформамида. После выдерживания реакционной смеси при 0^оС в течение 20 мин фильтрованием отделяют осадок дициклогексилмочевины, фильтратом обрабатывают 5,37 г L-фенилаланин-сефадекса, полученного на стадии 3. Реакционную смесь выдерживают 120 мин. Затем полимерный продукт отделяют фильтрованием и последовательно промывают диметилформамидом (5х25 мл), метанолом (2х25 мл), диэтиловым эфиром (2х15 мл). Полноту реакции контролируют реакцией с нингидрином. При отсутствии взаимодействия переходят к следующей стадии. Выход BOC-Gly-L-Phe-Seph 5,76 г. Стадия 5. Деблокирование BOC-Gly-L-Phe-Seph. 5,76 г BOC-Gly-L-Phe-Seph, полученного на стадии 4, заливают 25 мл 1 н. раствора п-толуолсульфокислоты в ледяной уксусной кислоте и выдерживают 90 мин. Деблокирующий раствор отфильтровывают, промывают уксусной кислотой (25 мл), метанолом (5х25 мл), диэтиловым эфиром (2х15 мл) и сушат на воздухе до постоянной массы при 25^оС. Выход продукта, представляющего собой TosOH˙Gly-L-Phe-Seph, 5,94 г. Стадия 6. Депротонирование TosOH Gly-Phe-Seph. 5,94 г полимерного продукта, полученного на стадии 5, обрабатывают при перемешивании 10%-ным раствором триэтиламина в диметилформамиде (2х25 мл) по 1 мин каждый раз, затем промывают диметилформамидом (2х25 мл), метанолом (2х25 мл), диэтиловым эфиром (2х15 мл). Объединенный фильтрат упаривают досуха, оставшуюся триэтиламмониевую соль п-толуолсульфокислоты растворяют в 1000 мл воды. По оптической плотности раствора, измеренной на спектрофотометре при λ260 нм, с использованием градуировочной кривой определяют количество свободных аминогрупп, равное 2,5 ммоль. Таким образом, выход Gly-L-Phe-Seph 5,51 г. Стадия 7. Ацилирование Gly-L-Phe-Seph действием BOC-D-Ala. 5,51 г Gly-L-Phe-Seph обрабатывают раствором, полученным взаимодействием раствора 2,84 г (15,0 ммоль) BOC-D-Ala в 15 мл безводного диметилформамида с раствором 1,55 г (7,5 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл диметилформамида, в условиях стадии 4. Выход BOC-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph 5,94 г. Стадия 8. Деблокирование 5,94 г BOC-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph проводят в условиях стадии 5. Выход TosOH˙D-Ala-Gly-L-Phe-Seph 6,12 г. Стадия 9. Депротонирование 6,12 г TosOH˙D-Ala-Gly-L-Phe-Seph проводят в условиях стадии 6. Количество свободных аминогрупп в целевом продукте 2,5 ммоль, т.е. выход D-Ala-Gly-L-Phe-Seph 5,69 г. Стадия 10. Ацилирование D-Ala-Gly-L-Phe-Seph действием O,N-di-BOC-L-Tyr. 5,69 г D-Ala-Gly-L-Phe-Seph обрабатывают раствором, полученным взаимодействием раствора 5,72 г (15,0 ммоль) 0,N-di-BOC-L-Tyr в 15 мл диметилформамида с раствором 1,5 г (7,5 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл диметилформамида, в условиях стадии 4. Выход 0,N-di-BOC-L-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Seph 6,60 г. Стадия 11. Деблокирование 6,60 г 0,N-di-BOC-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph проводят в условиях стадии 5. Выход TisOHx xL-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph 6,52 г. Стадия 12. Депротонирование 6,52 г TosOH˙L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph проводят в условиях стадии 6. Количество свободных аминогрупп в целевом продукте 2,5 ммоль. Таким образом, выход L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph 6,09 г Стадия 13. Ацилирование L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph действием BOC-D-Ala 6,09 г L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph обрабатывают раствором, полученным взаимодействием раствора 2,84 г (15,0 ммоль) BOC-D-Ala в 15 мл диметилформамида с раствором 1,55 г (7,5 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл диметилформамида, в условиях стадии 4. Выход BOC-D-Ala-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph 6,52 г. Стадия 14. Деблокирование 6,52 г BOC-D-Ala-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph проводят в условиях стадии 5. Выход TosOH˙D-Ala-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph 6,70 г. Стадия 15. Депротонирование 6,70 г TosOH˙D-Ala-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph проводят в условиях стадии 6. Количество свободных аминогрупп в целевом продукте 2,5 ммоль. Таким образом, выход D-Ala-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph 6,27 г. Стадия 16. Ацилирование 6,27 г D-Ala-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph действием BOC-D-Ala ведут в условиях стадии 13. Выход BOC-D-Ala-D-Ala-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph 6,70. Стадия 17. Отщепление от полимерного носителя сефадекса-LH-20 пептидного продукта аммонолизом. 6,70 г BOC-D-Ala-D-Ala-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-Seph, полученного на стадии 16, заливают 50 мл метанола и барботируют через взвесь газообразный аммиак в течение 60 мин. Затем реакционную смесь выдерживают при 0^оС в течение 24 ч. Далее процессы барботирования и выдерживания повторяют. Метанольный раствор отфильтровывают, упаривают на роторном испарителе. Остаток растворяют в 30 мл метанола и высаживают в 300 мл безводного диэтилового эфира. Осадок пептида отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром (2х20 мл) и сушат на воздухе. Выход BOC-D-Ala-D-Ala-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-NH₂ 1020 мг, т.е. 59% в расчете на первую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю. Продукт гомогенен, что подтверждено методом тонкослойной хроматографии на пластинках силуфола UV-254 в следующих системах: хлороформ метанол уксусная кислота (85:10:5), R_f 0,47; бензол ацетон (1:1), R_f0,62. Стадия 18. Деблокирование BOC-D-Ala-D-Ala-L-Tyr-D-Gly-L-Phe-NH₂. 1020 мг продукта, полученного на стадии 17, обрабатывают 20 мл трифторуксусной кислоты при перемешивании на магнитной мешалке в течение 30 мин. Реакционную смесь фильтруют. Фильтрат высаживают в 500 мл диэтилового эфира. Выпавший осадок пептида отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром (2х20 мл) и сушат на воздухе. Затем пептид растворяют в 30 мл метанола, фильтруют и фильтрат высаживают в 500 мл диэтилового эфира. Выпавший осадок пептида отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром (2х20 мл) и сушат на воздухе. Выход D-Ala-D-Ala-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-NH₂ 786 мг или 90% от количества защищенного продукта, полученного на стадии 17. [α]_D +10,8 (С0,5, АсОН). Степень чистоты продукта подтверждают методом ТСХ в системе н-бутанол-пиридин уксусная кислота вода (4:1:1:2), R_f0,73; с помощью высоковольтного электрофореза (U 900 В в 6%-ной уксусной кислоте), электрофоретическая подвижность: Е_HiS 0,45; Е_Gly 0,73. Методом аминокислотного анализа было определено содержание в полипептиде аминокислот: Ala 2,98; Gly 1; Phe 1; Tyr 1. Были проведены биологические испытания предлагаемого соединения. Биологические исследования проводили для определения ЛД₅₀ и изучения биологической активности нового вещества. Эксперименты вели на 16 наркотизированных (нембутал, 40 мг/кг) крысах и 30 ненаркотизированных мышах. У крыс регистрировали артериальное давление (АД, электроманометром) в сонной артерии и частоту сердечных сокращений (ЧСС). У мышей определяли токсические дозы по признаку выживаемости по методу Беленького М.Л. Соединение вводили мышам внутрибрюшинно в дозах 70-3000 мг/кг. Определенная величина ЛД₅₀ составляла 1310 мг/кг с доверительным интервалом 949-1908 мг/кг при Р 0,05. В гемодинамических исследованиях соединение вводили крысам внутривенно в дозах 2,5; 5 и 10 мг/кг. При этом исходный уровень АД и периода сердечных сокращений составлял 104±2 мм рт.ст. и 150±1 мс. Через 30±4 мин после введения предлагаемого соединения в дозе 2,5 мг/кг происходило повышение уровня АД на 17±2% При увеличении доз до 5 и 10 мг/кг латентный период гипертензивного эффекта не изменялся, но величина АД составляла 24±3 и 28±2% соответственно к исходному уровню давления. Повышение АД не сопровождалось достоверными сдвигами ЧСС. С помощью множественной регрессионной модели вида АД а₀ + а₁ lg D, где АД величина гипертензивного эффекта; а₀ и а₁ коэффициенты регрессии, рассчитанные по экспериментальным данным; lg D десятичный логарифм дозы, было найдено: С -75,84; а₁ 26,86; К 14; Т 11,7; Р < <0,001.50. Известные синтетические аналоги энкефалинового ряда, являющиеся естественными нейромедиаторами, обладает способностью кратковременно повышать АД только при введении соединения в структуру головного мозга. При внутривенном введении гипотензивный эффект не превышает 5-10 мин. Сравнительная оценка гемодинамических эффектов некоторых вазоактивных соединений приведена в таблице. Из таблицы видно, что предлагаемое соединение обладает гипертензивным действием, при наличии эффекта по величине АД, близкого к эффектам известных вазопрессорных аналогов другой структуры, по продолжительности действия предлагаемое соединение превышает эффект известных аналогов, например ангиотензина П, в 22 раза при очень малой токсичности и полном отсутствии побочных явлений. Кроме того, гипертензивный эффект предлагаемое соединение проявляет при внутривенном введении, в то время как у аналогов гипертензивная активность проявляется только при введении в определенные участки головного мозга.

Формула изобретения

Гексапептидамид формулы D-Ala-D-Ala-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-NH₂, обладающий пролонгированной гипертензивной активностью.