Способ получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к реассортанту вируса гриппа

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и касается получения гибридомы, продуцирующей мон АТ к реассортанту вируса гриппа. Способ заключается в том, что мышей иммунизируют концентратом соответствующего реассоранта вируса гриппа и извлекают селезенки. Параллельно получают клетки мышиной миеломы, сливают клетки селезенки и миеломы в соотношении 8:1 в присутствии полиэтиленгликоля мол. м. 6000. Полученные гибридные клетки выращивают в селективной питательной среде на фидерном слое тимуса сингенных мышей. Через 6-8 дней культивирование ведут в условиях лимитации аминоптерина, а после отмирания родительских миеломных клеток - лимитации гипоксантина и тимидина. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) А1

OllHGAHHE ИЗОБРЕТЕНИЯ, Н ASTOPCXO!VIV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ П (НТ СССР

1 (21) 4181350/28-13 (22) 12.01.87 (46) 30.05.89. Бюл. Ф 20 (71) Ленинградский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток (72) О.И.Варавикова, И.А.Созина, В.С.Вахин и Л.А.Зазимко (53) 578.085.23 (088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДОИЫ, ПРОДУЦИРУЮЩКИ MOHOKIIOHAHb%E АНТИТК

ЛА К РКАССОРТАНТУ. ВИРУСА ГРИППА (57) Изобретение относится к гидридомной технологии и касается получе; ния гибридомы, продуцирующей мон AT . к реассортанту вируса гриппа. Способ.

Изобретение относится к гидридом-. ной технологии и может быть использовано для получения моноклональнь1х антител (мон AT) к вирусу гриппа.

Аналогов в патентной и научно-технической литературе не выявлено.

Способ иллюстрируется следующим: примером, Пример. 10 мышей линии ВАЯВ/с трехкратно иммуниэируют очищенным ультрацентрифугированием в градиенте.

:плотности сахарозы концентратом реассортанта вируса гриппа А {Ленинград)

385(80)К. Первые две иммунизации про,. водят внутрибрюшинно с месячным интервалом, используя в каждом цикле иммунизации 10000 ГАК вируса на мышь.

Через две недели мышей иммунизируют ! внутривенно той же дозой вируса. Че-, рез 4 дня после этого мьппей забивают, (51)4 С 12 Б 5/00 А 61 К 39/42 заключается в том, что мьппей иммуни-, зируют концентратом соответствующего реассортанта вируса гриппа и извлекают селезенки. Параллельно получают клетки мышиной миеломы, сливают клетки селезенки и миеломы в соотношений

8:1 в присутствии полиэтиленгликоля мол. м. 6000. Полученные. гибридные клетки выращивают s селективной питательной среде на фидерном слое тимуса сингенных мышей. Через 6-8 дней культивирование ведут в условиях лимитации аминоптерина, а после отмирания родительских миеломных клеток— лимитации гипоксантина и тимидина.

1 табл. отбирают в асептических условиях селезенки, которые гомогенизируют в питательной среде RPM1 1640 иэ расчета

5 мл среды на одну селезенку. Гомоге-. низат центрифугируют в течение 7 мин при 1000 об/мин. Осадок отделяют де- кантированием надосадочной жидкости.

Клетки мьппиной миеломы линии NS-0

:культивируют 2 недели в питательной среде RP111 1640, дополнительно содержащей 15 об.Х сыворотки эмбрионов ,коров и 4,5 г/л глюкозы.. За день до слияния миеломные клетки пересевают с коэффициентом 1:2 в матрицы с вышеуказанной средой. Культивирование ми0 ,еломных клеток осуществляют при 37 С.

Непосредственно перед слиянием миеломные клетки снимают с матрацев встряхиванием и центрифугируют в указанном режиме. Осадок, содержащий

3 14829 миеломные клетки, используют в последующей операции.

Селезеночные и миеломные клетки смешивают в соотношении 8:1, отмывают средой КРМ1,1640, центрифугируют в том же режиме и добавляют к осадку

50 -ный раствор ПЭГ в той же среде, рН 8,0. Операцию слияния проводят в о, ° течение 15 мин при 37 С в водяной ба- 10 не. При этом через 1 мин после добавления ПЭГа (иэ расчета 1 мл раствора последнего на одну селезенку) клеточную взвесь разбавляют по каплям указанной питательной средой из расчета

10 мл на одну селезенку.

Далее смесь центрифугируют при том же режиме. К полученному осадку добавляют среду 1<РМ1 1640, содержащую 20 об. сыворотки эмбрионов ко- 20 ров, 4,5 г/л глюкозы, а также HAT.

При этом концентрация компонентов

НАТ составляет 1 мл 10 М водного раствора гипоксантина, 1 мл 4 х х 10 М водного раствора аминоптери- 25 на и 1 мл 1,6 10 M водного раствора тимидина на 100 мл среды. Количество среды с указанными добавками берут из расчета посевной дозы гибридом

10 клеток на 1 лунку. ф

Полученной взвесью гибридных клеток заполняют лунки трех 96-луночных планшетов (по 0,2. мп в лунку). 3а .1 день до операции слияния в названные лунки вносят по 10 клеток тиму6 са сингенных мышей.

Планшеты помещают в инкубатор при

:37 С, 80 -ной относительной влажнос;ти и содержании СО в воздухе 5 .

Через 7 дней инкубирования из се-, лективной среды исключают аминопте,рин. Для этого находящуюся над слоем клеток среду отсасывают и замещают на среду RPM1 1640 содержащую сыворотку эмбрионов коров глюкозу гипокУ

35 сантин и тимидин в указанных концентрациях.

Еще через 7 дней находящуюся над слоем клеток среду вторично отсасывают и замещают на среду RPM1 1640, содержащую сыворотку эмбрионов и глюкозу в указанных концентрациях, исключая тем самым гипоксантин и тимидин. В этой среде культивирование продолжают в течение 2 мес. 55

По мере образования клонов гибридом, занимающих не менее 1/4 поверхности лунки, часть культуральной жидкости отбирают и тестируют, произво43 дя при этом отбор позитивных клонов..

Тестирование проводят в РТГА с 1 ной взвесью эритроцитов кур, а также в иммуноферментном анализе (ИФА) . О наличии позитивных клонов судят по факту торможения гемагглютинации в

РТГА и/или положительному ответу в

ИФА. Эти клоны отбирают и размножают в матрацах, заполненных 15 мл питательной среды RPM1 1640, дополнительно содержащей 20 об. сыворотки эмбрионов коров и 4,5 г/л глюкозы.

Получают целевой продукт — гибридомы, продуцирующие мон AT к использованному реассортанту вируса гриппа с обратным титром в РТГА 16-32, а в

ИФА — 1000-2000 (см. таблицу).

В таблице представлены результаты тестирования в РТГА трех моноклонов, полученных гибридом с вариантами НЗН2 и H1N1 вирусов гриппа типа А.

Как видно из таблицы, моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами 1 и 3 клонов, 1 и 3 обладают более узкой специфичностью, чем при использовании клона 2.

Полученные мон АТ высокоспецифичны в отношении вирусов гриппа, относящихся к серотипу НЗИ2.

Характеристика полученных и испытанных гибридом гибридома клона 1.

Наименование клона гибридомы XI вид гибридоны В-клеточная, родительские клетки гибридомы: злокачественный партнер — NS-0/1, нормальный партнер — спленоциты мыши BALB/с, иммунной к вирусу гриппа А(Ленинград/

/385) 80 (НЗИ2) R.

Специфическая активность гидридомы. Специфически активна к гемагглютинину вируса гриппа А(Ленинград/

/385) 80 (НЗМ2) R в РТГА и ИФА.

Синтез антител (их специфичность) .

Значение титров антител: 1:32 в РТГА и 1:2000 в ИФА — в культуральной жидкости, 1:640 - 1:1280 в РТГА — в асцитной жидкости. Класс иммуноглобулинов G.

При культивировании в организме мышей образует твердые и асцитные формы опухолей. Образование асцитов на 14-18 день.

Гибридома клона 2. Наименование клона гибридомы Х2. Вид гибридомы Вклеточная. Родительские клетки гибридомы: злокачественный партнер—

NS-0/1, нормальный партнер — сплено1482943 6

Формула изобретения

РТГА с 4 IAE вирусов при разведении асцитической жидкости в клоне

Тест-вирусы

1 1 2 3

320 640

160 80

80 40

40 80

320 640

80 <20

80 80

80 20

А(Бангкок/1) 79 (H3N2) 160

А(Техас/1) 77 (H3N2) 20

А(Филиппины/2) 83 (НЗИ2) 80

А(Бангкок/2)79 (H3N2) 80

А(Ленинград/385)SOR (ПЗИ2) 160

А(Прага/1) 84 (Н1И1) (20

А(Киев/53) 79 (Н1И1) <20

А(Хабаровск/74) 77 (81N1) <20

Составитель Г.Смирнова

Редактор М.Недолуженко Техред М,Дидык - Корректор С.Шекмар

Заказ 2785/21

Тираж 500

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-.издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул . Гагарина, 101

5 циты мыши BALB/ñ иммунной к вирусу гриппа А(Ленинград/385) 80 (IIÇN2) R.

Специфическая активность гибридомы. Специфически активна к гемагглю»тинину вируса гриппа А(Ленинград/

/385)80 (H3N2)R в РТГА и ИФА.

Синтез антител (их специфичность) .

Значение титров антител 1:32 в РТГА и 1:2000 в ИФА — в культуральной жидкости, 1:640 — в РТГА в асцитной жидкости. Класс иммуноглобулинов G.

При культивировании в организме мьнпей образует твердые и асцитные формы опухолей. Образование асцитов на 14-18 день.

Использование способа позволяет получать мон AT к реассортанту вируса гриппа.

Способ получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к реассортанту вируса гриппа, заключающийся в том, что клетки селезенки мышей, иммунизированных концентратом реассортанта вируса гриппа, сливают с клетками мышиной миеломы при соотношении клеток 8: 1 соответственно в, присутствии полиэтиленгликоля мол.м.

6000 и гибридные клетки выращивают в селективной сфеде на фидерном слое тимуса сингенных мышей в условиях лимитации аминоптерина через 6-8 дней вйращивания, а гипоксантина и тимидина после отмирания родительских миеломных клеток.