Способ диагностики гипертонической болезни

 

Изобретение относится к медицинской области, а именно к способам биохимического тестирования сыворотки крови для ранней диагностики гипертонической болезни. Целью изобретения является увеличение точности способа выявления больных гипертонической болезнью на ранних стадиях ее развития. Эта цель достигается тем, что, кроме исследования действия сыворотки крови пациента на активность NA, K - АТФазы, с последующей оценкой степени ингибирования, % (A), дополнительно проводят электрофорез сыворотки крови, определяют процентное содержание в ней белков с мол.мас. 12 кД (B) и 15 кД (C). Затем расчитывают индекс риска /У/ по формуле У=0,096A ± 0,6B + 0,39C - 8,31 при значениях индекса риска ≥-0,2 выявляют гипертоническую болезнь. При использовании предложенного способа вероятность правильной классификации пациентов на людей с гипертонической болезнью и с нормальным артериальным давлением составляет 100% и на 40% увеличивается точность диагностирования по сравнению с известными способами за счет использования в независимых друг от друга параметров, сопутствующих гипертонической болезни.

СООЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК июЫ),в 3 49

1

1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4277290/28-14 (22) 06.07.87 (46) 30,07.89. Бюл, ?"- 28 (71) МГУ им. М.В.Ломоносова (72) E.À.Рогаева, О.Д.Лопина, А.M.Ðóáöîâ, А.А.Болдырев, Н.Н.Жигарева, Н.В.Перова и А,А.Александров (53) 612.0!5 (088.8) (56) Clin. and Exper — Theory and

Pracfice, 1985, А7 (5-6), 735-753. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРТОНИ- . 1ЕСКОЙ БОЛЕЗНИ (5?) Изобретение относится к медицине, а именно к способам биохимического тестирования сыворотки крови для ранней диагностики гипертонической болезни. Целью изобретения является увеличение точности способа выявления больных гипертонической болезнью на ранних стадиях ее разви- тия. Эта цель достигается тем,что, Изобретение относится к медицине, а именно к способам биохимического тестирования сыворотки крови для вы-. явления ранней стадии развития гипертонической болезни. Цель изобретения — увеличение точности диагностики, Получение сыворотки крови.

Кровь из локтевой вены ."0 мин выдерживают при 4 С, затем центрифугируют (!500 g, 10 мин) и полученную сыворотку до анализа хранят при -20 С.

Получение очищенного препарата

Na,К-АТФазы. (5! )4 G 01 N 33 68 61 В 10/00

2 кроме исследования действия сыворотки крови пациента на активность

Na,К-АТФаэы, с последующей оценкой степени ингибирования, 7 (А), дополн;=- тельно проводят электрофорез сыворотки крови, определяют процентное содержание в ней белков с мол.мас.

12 кД (В ) и 15 кД(С ) . Затем расчитывают индекс риска (У) по формуле У =

= 0,096А + 0,6B + 0,39 С вЂ” 8,31. При значениях индекса риска ) -0,2 выявляют гипертоническую болезнь. При использовании предложенного способа вероятность правильной классификации пациентов на людей с гипертонической болезнью и с нормальным артее риальным давлением составляет 100% и на 407 увеличивается точность диагностирования по сравнению с известными способами эа счет испольэования в независиь.ых друг от друга параметров, сопутствующих гипертоничес1ш4 кой болезни, 2 табл, В основу метода выделения Na

К-АТФазы положен принцип, предложенный Хопкинсом. Для выделения используют солевые железы домашних уток, которым 10 дней вместо воды дают

0,2 М NaC1. К 5 r измельченных желез добавляют !0-кратный объем среды выделения (0,25 М сахароза, 20 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА; рН 7,4 при

40 С) и гомогениэируют ножевым гомогенизатором при 4500 об/мин 4.раза по 30 с с интервалами в 1 мин. Гемогенат фильтруют через 3 слоя марли и центрифугируют !5 мин при 5000g, о

Супернатант хранят при 4 С, а осадок

3 1497575 р1суспендируют в 10 мл среды выделен4 я и центрифугируют в том же режиме. Затем супернатанты объединяют и центрифугируют l ч при 450008, Полученную микросомальную фракцию ресуспендируют в 2,5 мл среды выделения и обрабатывают ДДС-Яа по методу

Йоргенсена, Микросомальный материал разводят в среде : 3 мМ АТФ, 2 мМ

Э ТА, 20 мМ Трис (рН 7,4 при 25ОС);. и KBIIJlHM добавляют ДДС-Na при пост янном перемешивании, при этом кон чная концентрация белка должна сост влять 1,4 мг/мл а содержание 15

С-Na O, l - O 5 мг/мл. После стояя полученного раствора 30 мин на о мфгнитной мешалке при 25 С, его порц гями, по 3,5 мп, наслаивают на гра/ д ент плотности еахароэы, составлен- 20

HItIÀ в центрифужных пробирках на

Зб.мл: 13,5 мл 29Х-ной, 8,0 мл

1 %-ной и 5,0 мл 10Х-ной сахарозы, В е растворы сахарозы готовят на буфере: 20 мМ Трис и 1 мИ ЭДТА (рН 7,4 25 о при 4 C) . После центрифугирования (210 мин, 105000@ при 4 С) осадки объединяют и суспендируют в 1,5 мл середы выделения. Полученный препарат Na, К-АТФазы разливают по 100 мкм ЗО в пластмассовые пробирки и хранят п и -20 С не более 2 мес. Концентрао ц белка в препарате, определяемая м тодом Лоури, составляет 1-3 мг/мл, а! активность Na К-АТФазы 1000—

1 00 мкмоль A+7Mr белка в 1 ч, Фермфнтный препарат не содержит Ng-АТФазй.

Определение степени ингибирова" ния Ма, К-АТФазы сывороткой крови.

Активность фермента измеряют с

250 мкл сыворотки и без нее (250 мкл

Н О) в 1 мл среды инкубации, мИ:

МФС1 90; КС1 60; МоС1 < 3; АТФ. 3; ийидазоп 30:(рН 7,4 при 37 С). Реакцию гидролиза АТФ начинают добавлением ферментного препарата (10

20 мкг) и после 5-10 мин инкубации останавливают добавлением трихлоук50 сусной кислоты до конечной концентрации 10 %. После осаждения белка (1200 g, 5 мин) в супернатанте измеряют содержание Ф м методом ФискеСуббароу. Г гепень ингибирования активности Na К-АТФазы рассчитывают в Х как разницу между величинами активности фермента с (100% ) и без сыворотки в среде инкубации. ф о

Определение содержания в сыворотке крови белков с мол.массой 12 и

15 кД.

Методом электрофоретического анализа сыворотки крови определяют содержание в ней низкомолекулярных белков (%), используя соответствующие величины площадей пиков, полученных при сканировании электрофорегражчы на " Ш1газсап lazer densitometer2220" (1 кВ) при 550 нм, Предварительно сыворотку крови разводят,в 20 раз раствором. 0,025 M

Трис-НС1 (рН 6,8), 5Х глицерин, 2%

ДДС-Иа, 2,5Х р -меркаптоэтанол и нагревают при 80 Г 3 мин, Электрофорез в полиакриламидном геле проводят в присутствии ДДС-Na, используя прибор для вертикального электрофореза (В о — Rad, 220). Процесс длится

4 ч при постоянном токе 40 мА на пластину. Окрашивание белковых полос осуществляют 30 мин при 90 С в среде, Х. кумасси R-250 0,25; изопропанол 20; уксусная кислота 7. От избытка красителя гель отмывают в смеси

20% изопронанола и 7Х уксусной кислотыы.

Статистическую обработку данных осуществляли, используя программы

7Д, 6Д и 7М из пакета программ

BNgII-77 "для анализа биологических и медицинских данных. Наибольшую вероятность правильной классификации удалось получить только при использовании в пошаговом дискриминационном анализе комбинации всех трех измеряемых параметров сыворотки крови, на основе чего выведено каноническое уравнение (1). Подставляя в него значения степени ингибирования

Na, К-АТФазы сывороткой крови и содержания в ней белков с мол.массой

12 и 15 кД определяют индекс риска данного пациента, при значениях которого ) -0,2 выявляют гипертоническую болезнь.

Способ опробован на группе пациентов (20 человек) в возрасте от 16 .до 46 лет, 10 из которых имели нормальное артериальное давление, а

1O — страдали гипертонической бояезнью I-ЕЕ стадий. Все пациенты в течение 2 недель до начала обследования не принимали гипотензивных ле-: карств. Пациенты контрольной группы имели систолическое артериальное давление 4 140 мм рт.ст. и/или ди5 1497 астолическое с 90 мм рт.ст. диагноз гипертонической болезни ставился при систолическом давлении ) 160 Mk рт. ст ° и/или диастолическом > 95 мм рт.ст., при отсутствии клинических данных, подтверждающих симптоматический характер повьппения артериального давления.

Пример 1. Определение индек- 10 са риска для пациента с гипертонической болезнью.

Определяли степень ин1.ибирования

Na, К-АТФазы сывороткой крови.Реакцию ферментативного гидролиза АТФ 15 проводили в двух центрифужных пробирках, содержащих по 1 мл среды инкубации. В одной находилось 250 мкл сыворотки, а в другой 250 мкл Н О.

Реакцию начинали добавлением 1 5 мкг 20 ферментного препарата, предварительно полученного из солевых желез уток. После 5 мин инкубации при

37 С реакцию останавливали добавлением трихлоруксусной кислоты (конечная концентрация 1O ), сывороточный белок удалили центрифугированием (1200 g, 5 мин). В супернатанте выделили содержание Ф„ методом Фиске-Суббароу, измеряя оптическую плот- 30 ность относительно контрольной пробы на фотоэлектрокаллориметре (ZaI" при 650-660 нм в 5 мм кюветах. В контрольные пробы, содержащие либо

250 мкл сыворотки, либо 250 мкл Н<О, препарат Na К-АТФазы после трихлоруксусной кислоты не добавляли.

Активность Na Л-АТФаэы беэ сыворотки составляла 1200 мкмоль Ф„/мг белка в 1 ч, а с ней — 240 мкмоль

Ф /мг белка в 1 ч, что соответствует 80 -ному ингибированию фермента.

Для определения содержания в сыворотке крови белков с мол.массой

12 и 15 кД проводили электрофорез образцов сыворотки крови в полиакриламидном геле в присутствии ДДС-Na. а

Процентное содержание в сыворотке крови белка 12 кД составило 4,0Х, а

15 кД белка 2,2 .. Полученные величины подставляют в уравнение (1):

Y = 0 096. 80 + 0,6 4,0 +

+ 0,39-2,2-8,31 = 7,6.

Таким образом, Y ) -0,2.

Пример 2, Определение индекса риска для пациента с нормальным уровнем артериального давления, 575 б

Степень ингибирозания Ма, К-АТФазы сывороткой крови и содержа не в ней 12 и 15 кД белковых компонентов определяли по примеру 1.

Активность Na К-АТФазы беэ сыво-. ротки крови составляла 1200 мкмоль

< /мг белка в 1 ч, а с ней

67"; мкмоль Ф„/мг белка в 1 ч, что составляет 59Х от первой величины и соответствует 41Х-ному ингибированию

Na, К-АТФазы. Содержание в сыворотке крови белков с мол.массой 12 и

15 кД составляло 2,0 и 1,5Х соответс-.венно. Подставляя полученные величины в уравнение (1):

У = 0,096 ° 41 + 0,6 2,0 +

+ 0,39 1,5-8,39 = -2,6, получают У <-0,2.

Пример 3. Определение индекса риска при его пограничном значеl нии для пациента с гипертонической с болезнью.

Степень ингибирования Na, К-АТФазы сывороткой крови и содержание в ней 12 и 15 кД белковых компонентов определяют по примеру

Активность Na, К-АТФазы беэ сыворотки составляла 1200 мкмоль Фн/мг белка в 1 ч, а с ней — 685 мкмоль

Ф„/мг белка в 1 ч, что соответствует 43Х-ному ингибированию фермента.

Содержание в сыворотке крови белков с мол,массой 12 и 15 кП составляло

3,2 и 5,2 Х соответственно. Полученные величины подставляют в урав,ооние (1 ):

Y = 0 096 43 + 0,6 3,2 +

+ 0,39 ° 5 2 — 8,31 = — 0,2.

Приведенные примеры показывают, что предлагаемый способ диагностики гипертонической болезни позволяет выявить ранние стадии развитий болезни, не прибегая к длительным клиническим исследованиям. Биохимическое тестирование сыворотки крови может быть применено при массовых профилактических обследованиях пациентов.

В среднем для группы больных характерны как более высокий уровень ингибирования сывороткой крови Na, К-АТФазы, так и более высокое содержание в сыворотке белков с мол.мас-сой 12 и 15 кД, а также их суммы (табл..1). При высоком уровне достоверности различий измеряемых парамет1497575 ров между группами (табл.2) наблюдан1тся значительные отклонения от среднего9 поэтому .значения измеряемых параметров для контрольной и опытной групп существенно перекрываются. Таким образом, каждый из этих параметров по отдельности не может бысть использован для диагностики гиле тензивного состояния. В то же вр мя корреляционный анализ показал, чт эти параметры не связаны между со ой (табл,2). Методом пошагового ди криминационного анализа показано, чт наилучших результатов, т.е.

10 -ную вероятность правильной

\ кл ссификации, удается получить то ько при использовании всех трех па аметров сыворотки крови. действия сыворотки крови пациентов на активность препарата Иа9 К-АТФазы с последующей оценкой степени ингибирования фермента, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения точности способа, дополнительно проводят элетрофорез сыворотки крови, определяют процентное. содержание в ней белков с мол.массой 12 и 15 кД, затем рассчитывают индекс риска Y по формуле

Y = 0,О96 А + 0,6 В + 0,39 С—

8,31, (1) где А — степень ингибирования Na, К-АТФазы, М;

 — содержание белков с мол.массой 12 кД,Х;

20 С вЂ” содержание белков с мол.массой 15 кД, Х, и при значених индекса риска более или равном -0,2 диагностируют гипертоническую болезнь.

Ф 9рмула из обретения

,Способ диагностики гипертоническо болезни, включающий определение

Таблица1

Сыворотка крови людей с гипертонической болезнью

Сыворотка крови людей из контрольной группы одержание белка,X Индек риска

12 кД 15 кД

Стфпень ин-C .г и ир ов ания

Na K-АТФа ы, 7.

Степень ингибирования

Na K-АТФазы, 7.

Содержание белка,X Индекс риска

12 кД 15 кД

88

72

68

67

67

62

43

70 79 4 1

1,5

4,.0

4,0

3,9

5,2

4,6

2,0

5,0

6,0

3,2

3,9 0 4

3,3

2,2

1,2

4,6

l,9

3 8

2,3

1,9

5,2

2,810,4

293

2,8

2,6

1,7

3 5

1 97

0,8

2,0

2,0

0,2

1,9й0,4

73

60 .59

57

52

48

48

48

46

41

53,2+2,9

О

1,9

О

О.

1,3

2,0

1,0

О

5,9

2,0

1,4+0,6

О

1,9

О

1,4

2,1

2,1

1,9

1,5

3,6

1,5

1,6+О, 3

1,3

0,7

2,6

2,3

1,7

1,7

2,4

3,1

1,0

2,6

1,9 0,3

1497575.

Таблица2

Содержание белковых компонентов, 7, 1

ИнгибиГруппа людей

Варьирование рование

Иа,К-АТФазы

12 кД 15 кД 12 + 15 кД величин

Контрольная

Опытная

Составитель Н,Гуляева

Техред ll Îëèéíûê Корректор Л, Бескид

Редактор Л.Пчолинская

Заказ 4439/47 Тираж 789 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР:.

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

Максимум

Минимум

Среднее

Максимум

Минимум

Среднее

Р а.

5,9

1,4 + 0,6

6,0

1,5

3,9+0,4

0,0026

3,6

1,6 0,3

5,2

1,.2

2,8Т0,4

00402

9,5

3,0 0,4

9,8

4,8

6,7+0,4 °

0,016

41

53,2+ 2,9

43

70,7Т4,1

0,0026