Способ определения активности цитолитических ферментов

 

Класс ба, 22,4 № 150808

СССР

Ж

l .Ф

iu! (!ф.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Подписная группа № 14

Л. С. Салманова

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ЦИТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Заявлено 12 декабря 1961 г. за № 755319/28-13 в Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Опубликовано в «Бюллетене изобретений» № 20 за 1962 г.

Известно, что цитолитические ферменты содержатся в прорастающих зернах, в значительных количествах продуцируются различными грибными культурами и представляют собой комплекс ферментов. Определение активности цитолитических ферментов затрудняется отсутствием субстрата, по разрушению которого можно было бы судить об активности основного компонента комплекса ферментов — цитазы.

Предлагается способ, позволяющий объективно определять активность цитолитических ферментов, что дает возможность уточнить приемы технологии при производстве спирта, особенно при переработке несоложенного сырья.

Особенность способа состоит в том, что за единицу активности цитазы принимают количество грибной культуры или ферментного препарата, или солода, которое в течение 2 час при температуре 40 образует из соответствующего количества субстрата 10 мг ксилозы или глюкозы.

3а единищу активности гемицеллюлозы принимают количество грибной культуры или ферментного препарата, или солода, которое в течение

2 час при температуре 40 образует из пентозанов соответствующего количества субстрата 10 мг ксилозы или глюкозы.

Способ может быть осуществлен следующим путем.

Общая активность цитазы. В 10 мг субстрата (ячменя) вносят 2 мл грибной вытяжки (1: 2) и 70 мл дистиллированной воды. Для контроля на такое же количество субстрата вносят 2 мл инактивированной вытяжки. Определение проводят в стаканах заторного аппарата при работе мешалок в течение 2 час при температуре 40 . По окончании цитолиза содержимое стаканов доводят до 200 г, отфильтровывают и

¹ 150808 в фильтрах определяют редуцирующие вещества по Бертрану. Разница в содержании редуцирующих веществ между опытом и контролем соответствует количеству редуцирующих веществ, которое образуется из клеточных стенок ячменя под действием цитолитических ферментов

Активность гемицеллюлозы. В коническую колбу емкостью 100 мл вносят 0,7 г субстрата (ячменя), 10 мл фосфатно-цитратного буфера рН = 4,6 и 10 мл дистиллированной воды. Смесь выдерживают на водяной бане при температуре 45 в течение 15 мин. Затем в смесь вносят вытяжку из грибной культуры, полученную настаиванием ее с 2 ч. дистиллированной воды в течение 5 час при температуре 20, доводят объем реакционной смеси до 25 мл, колбу закрывают резиновой пробкой и выдерживают в течение 2 час при температуре 40 . По окончании цитолиза действие фермента прекращают 20-минутным кипячением на водяной бане. Затем содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр и в фильтрате определяют количество редуцирующих веществ по Бертрану.

Так как сам субстрат не содержит редуцирующих веществ, а гемицеллюлозы с растворами Фелинга при определении редуцирующих веществ по Бертрану дают гели, затрудняющие это определение, то контроль с инактивированной грибной вытяжкой не ставится, а из общего количества редуцирующих веществ, определенных в опыте, вычитаются редуцирующие вещества, содержащиеся в грибной вытяжке.

Активность цитолитических ферментов выражается в единицах. 3а единицу цитазы гемицеллюлозы принимают то количество грибнои культуры или ферментного препарата, или солода, которое в течение

2 час при температуре 40 образует в первом случае (активность цитазы) из субстрата, а во втором случае (активность гемицеллюлозы) из пентозанов субстрата 10 мг ксилозы (или глюкозы).

Пример расчета активности гемицеллюлозы. В 0,7 г субстрата внесено 0,25 мл грибной вытяжки, 10 мл буфера и 14,75 мл дистиллированной воды.

При определении редуцирующих веществ в реакционной смеси после цитолиза на 10 мл ее фильтрата затрачено 4,3 мл КМп04 (Т = 10,14), что соответствует 55,62 мг ксилозы во всей реакционной массе.

Определив, что в 0,25 мл грибной вытяжки, взятой для анализа,. содержится 2,0 мг ксилозы, находят фактическое количество редуцирующих веществ, образующихся из субстрата под действием гемицеллюлозы: 55,62 — 2,0 = 53,62 мл ксилозы.

Так как 0,25 мл грибной вытяжки (1: 2) соответствует 0,125 г грибной культуры, то находят, что под действием 1 г культуры из субстрата образуется:

0,125 грибной культуры — 53,62 мг ксилозы

1 г грибной культуры — Х

Х = 428,9 мг ксилозы, что в пересчете от пентозанов гемицеллюлозного субстрата составляет 1082,5 мг ксилозы, а активность гемицеллюлозы данной грибной культуры равна 108,25 единицам.

Предмет изобретения

1. Способ определения активности цитолитических ферментов, отл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью объективного определения активности цитолитических ферментов, за единицу активности цитазы принимают количество грибной культуры или ферментного препарата, или солода, которое в течение 2 час при температуре 40 образует из соответствующего количества субстрата 10 мг ксилозы или глюкозы. № 150808

Составитель А. В. Нечайкин

Редактор О. Д. Ус Техред А. А. Камышникова Корректор С. Ю. Цверина

Объем 0,26 изд. л.

Цена 4 коп.

Формат бум. 70 Q 108 />s

Тираж 650. ЦБТИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Центр, М. Черкасский пер., д. 2/6.

Подп. к печ, 25/XII — 62 r

Зак. 3769/11

Типография, пр. Сапунова, 2.

2. Способ по п. 1, отл ич а ю щи и с я тем, что за единицу активности гемицеллюлозы принимают количество грибной культуры или ферментного препарата, или солода, которое в течение 2 час при температуре 40 образует из пентозанов соответствующего количества субстратов 10 мг ксилозы или глюкозы.