Способ идентификации ингибиторов l-амилаз

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союэ Соввтскин

Социапистичвсиин

Республик

<и> 969720

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l ) Дополнительное к авт. свид-ву (5! )М. Кл. (22)»» «o 10.03.81 (21) 3258824/30-15 с присоединением заявки ЭЙ (23) Приоритет

С 12 Я .1/40

3ЬеудерстеопаВ квинтет

СССР во делан нзе4ретеннй н отнрытнй

Опубликовано 30. 10. 82. Бюллетень № 40

Дата опубликования описания 03.11.82 (53) УДК 577 15:

:578.088.7 (088.8) (72) Автор изобретения

А.В. Конарев

Всесоюзный ордена Трудового Красного Зн научно-исследовательский институт защит (71) Заявитель (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНГИБ"ТОРОВ

cL""ÀNÈJ1À3

Изобретение относится к защите и биохимии растений, а также к физиологии пищеварения.

Известны способы выявления компонентов амилаз в электрофоретических спектрах белков посредством проведения ферментативных реакций в разделяющем геле 11 ), Однако эти методы не позволяют выявить ингибиторы с -амилаз.

Наиболее близким является способ проведения электрофореза белков-ингибиторов из зерна пшеницы с последующим выделением отдельных компонентов из геля для определения ингибирующей активности. Для этого белки фракционируют высаливанием сульфатом аммония и различными методами хроматографии. Разные фракции белков разделяют электрофорезом в 7,53-ном полиакриламидном геле при рН 8,9 по Орнштейну и Дэвису. Зоны, содержащие отдельные компоненты, вырезают из геля и из них выделяют белок. В случае

2 препаративного электрофореза отдельные компоненты элюируют из геля. Активность ингибиторов определяют обычными методами в пробирках (2 ).

Однако известные способы требуют высокой очистки белков-йнгибиторов, что сопряжено с использованием сложных приборов и большими затратами времени. Это затрудняет массовый анализ образцов, Цель изобретения - повышение разрешающей способности и производительности способа.

Укаэанная цель достигается тем, что электрофорез проводят в полиакриламидном геле, содержащем крахмал и о(,-амилаэу в концентрации, достаточной для полного разрушения крахмала, после электрофореза гель инкубируют при 20-37оС и рН 5,4-7,0 30-90 мин и окрашивают раствором йода.

Белки выделяют из муки 3-кратным объемом трис-глицинового буфера в течение 4,-12 ч при 4 С. После центри3 9697 фугирования экстракт прогревают на

1 водяной бане 10-40 мин при 70-90оС для инактивации собственных амилаз зерна. После этого 1-15 мкл белка наносят на .гель для электрофореза.

Электрофорез проводят в турбках или пластинах 5,8 /-ного полиакриламидного геля. Гель содержит 0,05-0,103 крахмала и исследуемую о -амилазу в концентрации, достаточной для полного 16 разрушения крахмала в геле за 1 ч при оптимальных для фермента условиях.

Так как рН буфера в геле, равный 8,3, отличается от оптимального для мноrvlx oL-амилаз, в процессе разделения белков фермент неактивен, Низкая ионная сила буфера (0,0074 М трис-0,057 И, глицин) позволяет быстро изменить рН в геле для активации фермента после электрофореза, Для этого гель поме щ щаот в буфер с рН 5,4-7,0, оптимальным для изучаемой о(.-амилазы, Оптимальный рН буфера для о -амилаз насекомых

5,4, а для с -амилаз млекопитающих 7,0.

d-Амилаза разрушает весь крахмал в рз геле за исключением тех зон, в которых присутствует специфичный ингибитор данного фермента. Другие белки не препятствуют действию амилазы. Зоны, в которых остается неразрушенный крахмал, окрашиваются раствором иода в синий цвет; Гель фотографируется на фотопленку s проходящем свете. Степень специфичности. отдельных компонентов ингибитора можно определить ко.личественно на денситометре.

Пример 1. Определение ингибиторов d-амилазы кишечника вредной черепашки.

Несколько,зерей; размалывают. в муку. В 100 мг муки заливают 300 мкл

0,0074 M трис-0,057 И глицинового буфера и оставляют на 4 ч при 4 C.

Смесь центрифугируют при 8000 об/мин.

Надосадочную жидкость прогревают

15 мин при 80оС для инактивации амилаз зерна. Электрофорез проводят в горизонтальных пластинах полиакриламидного геля 125х125х2, 1 мм. Гель имеет

10 лунок для нанесения образцов. Состав геля в расчете на 100 мл смеси:

50 акриламид 5,8; метилен-бис-акриламид

0,21 r; ТЕИЕД 0,05 мл; раствор рибофлавин 5 мл (4 мг/100 мл) (добавляют непосредственно перед полимеризацией) .

Смесь доводят до .100 мл трис-глицино- вым буферои рН 8,3, содержащим 0,1 крахмала. В раствор добавляют с -ами1лазу из кишечника клопа в концентрации, 20 а достаточной для разрушения всего крахмала в геле за 60 мин в буфере с рН 5,4 и при 37 С. Эту концентрацию подбирают предварительно обычными мето- дами в пробирках. Гель полимеризуют на свету в течение 30 мин. В качестве электродного используют тот же буфер, что и в геле. Исследуемый раствор белка наносят в лунки для образцов. При размере лунки 8 1 2 мм наносят 15 мкл экстракта. Электрофррез ведут с охлаждением при 10ОС в течение 60 мин при силе тока 25 мА и напряжении 700 В. После электрофореза гель помещают в ацетатный буфер с рН 5,4,содержащий 0,1 И NaCl и 0,001 M СаС1 . Гель инкубируют в буфере 60 мин при 37 С и помещают в о раствор иода (100 мг иода и 300 мг

KI на 0,5 л воды) . Зоны,в которых присутствуют ингибитор с -амилазы черепашки, окрашивается в синий цвет.

Гель фотографируют в проходящем свете. Для изучения количественных характеристик спектра продуктов реакции ингибирования гель сканируют на денситометре. Для контроля часть спектров альбуминов зерна проявляют на белок в 10 -ной трихлоруксусной кислоте.

Пример 2. Проводят те же операции по выделению белка, как в примере 1. Надосадочную жидкость прогревают 10 мин при 70ОС. В таких условиях активность ингибиторов сохраняется лучше, но есть вероятность того, что амилазы зерна инактивируются не полностью, Это может исказить результаты анализа. Состав геля -, как в. примере 1, но концентрация крахмала

0,054. Наносят 5 мкл образца на лунку. Спектр продуктов реакции ингибирования о -амилазы может получиться недостаточно контрастным.

Пример 3 ° Те же операции, что и в примере 1 но надосадочную жидкость прогревают 40 мин при 90оС.

Ингибиторы могут потерять значитель ную часть своей активности, зато собственные амилазы зерна инактивируются полностью. Такие условия могут быть полезны при работе с образцами, в которых трудно инактивировать амилазы, например с белками незрелого или пророщенного зерна. Если концентрация игибиторов в экстракте намного выше, чем в примере 1, то при нанесении 15 мкл образца на лунку отдельные компоненты ингибиторов моформула изобретения

5 969 гут слиться, что затруднит анализ.

При недостаточном охлаждении гель может нагреться в ходе электрофоэера.

При нагреве до температуры выше 15 С е -амилаза- в геле может активировать- S ся, что исказит конечнЪ|е результаты.

Пример 4. Для идентификации ингибиторов aL-амилаз слюны человека, панкреаса свиньи и собственных Ы;амилаэ пророщенного зерна условия осуществления способа te же, что и в примере 1. Одйако оптимальное количество наносимого на гель экстракта меняется в зависимости от чувствительности о -амилазы к ингибиторам. На . И гель с о -амилазой слюны человека наносят 0,5-2,0 мкл, панкреаса свиньи - 3-5 мкл и пророщенного зерна12-15 мкл. Гели с с -амилазами человека и свиньи инкубируют в трис-верона- 2о ловом буфере рН 7,0, а зерна - в ацетатном буфере рН 5,4.

Пример 5. Для идентификации .ингибиторов о(;амилаз мучного хрущака в условия осуществления способа, 25 описанные в примере 1, необходимо внести некоторые изменения. Поскольку с ;амилаза хрущака обладает более высокой подвижностью в электрофорезе, чем пшеничные ингибиторы, разделяю- щ ,щий гель полимеризуется так, чтобы

720 d лунки для образцов находились посредине между катодным и анодным концами геля. Длина геля 250 мм, Это позво,лит компенсировать высокую подвиж ность фермента, В связи с очень высокой чувствительностью фермента к ингибиторам количество наносимого экстракта необходимо уменьшить в 500 1000 раз по сравнению с примером 1.

Способ идентификации ингибиторов

d;амилаз, включающий электрофорез в полиакриламидном геле, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повыше" ния разрешающей способности и производительности, электрофорез проводят в полиакриламидном геле, содержащем крахмал и 4.-амилазу в концентрации, достаточной для полного разрушения крахмала, после электрофореза гель инкубируют при 20-37ОС и рН 5,4-70

30-90 мин и окрашивают раствором йода.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Маурер Г. Диск-электрофорез.

1971.

2. Biochim. Biophis. Acta, 1973, ч. 317, р. 139 148.

Заказ 31 /27 Тираж 505

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж- 35 Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, Составитель Т. Чечеватова

Редактор В. Петраш Техред,Ж.Кастелевич Корректор M°.