Штамм гриба aspergillus heteromorphus batista et maia - продуцент целлобиазы

 

Изобретение относится к биотехнологии. Цель изобретения - получение штамма повышенной активности. Штамм гриба Aspergillus heteromorphus Batista et maia BKM F-3010Д выделен из почвы. При культивировании в условиях глубинной ферментации на питательной среде, содержащей свекловичный жом, солодовые ростки, пшеничные отруби и минеральные соли, образует на 7 сутки культивирования от 35 до 48 ед/мл целлобиазы. Целлобиазная активность штамма при культивировании в условиях твердофазной ферментации на соломе составляет на 11 сутки культивирования 330 ед/г субстрата.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению целлобиаз, одного из компонентов целлюлаз, и может быть использовано для осахаривания целлюлозосодержащих субстратов и получения из них глюкозы. Цель изобретения - получение нового штамма грибов с повышенной активностью целлобиазы. Штамм Aspergillus heteromorphus Batista et Maia BKM F-3010 Д выделен из почвы острова Кунашир в 1983 году, лабораторный номер К 3/1. Описание культуры Aspergillus heteromorphus Batista et Maia BKM F-3010 Д. Культуральные признаки. Колонии гриба на среде Чапека при 24^оС на 9 сутки достигают 2,7-3,0 см в диаметре. Колонии бархатистые, в центре пушистые, край колоний неровный, морщинистый, белый, центр зеленовато-серый, обратная сторона слабо-желтая. На сусло-агаре колонии достигают 3,5-4,0 см в диаметре. Колонии ватообразные, ровные, от серовато-бурых до темно-оливковых тонов, обратная сторона не окрашена. Морфологические признаки. Конидиальные головки шаровидные, с возрастом растрескивающиеся, 250-300 мкм в диаметре. Конидиеносцы длинные, до 1 мм и 12,8-13,5 мкм в диаметре, пузырь сферический, 35,2-38,3 мкм в диаметре, фертильный. Стеригмы в основном в 2 ряда, но встречаются конидиальные головки с однорядными стеригмами, первичные 8,0 2,7-3,2 мкм, вторичные 7,3 2,7-3,2 мкм в диаметре. Конидии сферические, слабошероховатые, 6,7-8,0 мкм в диаметре. Культура гриба идентифицирована как Aspergillus heteromorphus Batista et Maia. Штамм Aspergillus heteromorphus BKM F-3010 Д образует целлобиазу. П р и м е р 1. Культивирование гриба Asp. heteromorphus et Maia ВКМ F-3010 Д проводят на круглой качалке в колбах Эрленмейера на питательной среде следующего состава, % : свекловичный жом 3,0; солодовые ростки 1,4; пшеничные отруби 0,5; КН₂РО₄ 0,2; NaNO₃ 0,4; (NH₄)₂SO₄ 0,4; MgSO₄ 7H₂O 0,03; вода до 100 мл; рН_исх 4,8. Питательную среду стерилизуют 1 ч при 1 атм, охлаждают до 30^оС и засевают суспензией спор плотностью 10 - 10 спор/мл. Культивирование проводят при температуре 28^оС, скорости вращения 180-200 об/мин, в динамике отбирают пробы, биомассу осаждают центрифугированием (5 тыс. об/мин 20 мин), целлобиазную активность определяют в культуральной жидкости по методу, разработанному А. А. Клесовым и соавторами. За единицу целлобиазной активности принимают количество фермента, которое гидролизует 1 мкмоль целлобиазы за 1 мин при инкубации с 2 ^.10^-3 М раствором целлобиазы в 0,05 М ацетатном буфере с рН 4,5 (0,1 М NaCl) при температуре 40^оС. Максимальная целлобиазная активность выявляется на 7 сутки культивирования и составляет 40 ед/мл. Максимальная целлобиазная активность культуральной жидкости лучшего из известных продуцентов целлобиаз при выращивании в аналогичных условиях составляет 23,2 ед/мл. П р и м е р 2. Культивирование проводят, как в примере 1, но концентрация свекловичного жома и солодовых ростков составляет соответственно 2,5% и 1,5% . Максимальная целлобиазная активность выявляется на 7 сутки культивирования и составляет 35 ед/мл. П р и м е р 3. Культивирование проводят, как в примере 1, но концентрация свекловичного жома, солодовых ростков и пшеничных отрубей составляет 3,5% , 1,0% и 0,4% соответственно. Максимальная целлобиазная активность выявляется на 7 сутки и составляет 48 ед/мл. П р и м е р 4. Культивирование гриба Asp. heteromorphus et Maia BKM F-3010 Д проводят в условиях твердофазной ферментации на среде, состоящей из 5 г соломы и 15 мл солевого раствора следующего состава, г/л: мочевина 0,5; КН₂РО₄ 2,0; (NH₄)₂SO₄ 1,4; NH₄Cl 1,0; MgSO₄ 0,3; CaCl₂ 0,4. Культивирование осуществляют в колбах Эрленмейера. Предварительно субстрат - солому стерилизуют при 1 атм в течение 1 ч, а затем вносят в каждую колбу по 2 мл суспензии спор плотностью 10⁶-10⁸ спор/мл. Культуру выращивают в термостате при 28^оС в течение 14 суток. Через каждые 2 суток в колбы добавляют по 5 мл солевого раствора для предотвращения высыхания среды. Пробы начинают отбирать через 5 сут культивирования. Фермент смывают с субстрата путем добавления в колбу 100 мл 1% -ного водного раствора твина 80 на качалке в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем субстрат с биомассой гриба отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин 20 мин). Максимальная целлобиазная активность выявляется на 11 сутки и составляет 17 ед/мл или 330 ед/г субстрата. П р и м е р 5. Культивирование проводят, как в примере 4, но в качестве продуцента целлобиазы используют культуру Asp. japonicus Saito ВКМ F-2632 Д. Максимальная целлобиазная активность на 11 сутки культивирования составляет 9,8 ед/мл или 198 ед/г субстрата. П р и м е р 6. Культивирование проводят, как в примере 4, но в качестве продуцента целлобиазы используют культуру Aspergillus awamori F-122. Максимальная целлобиазная активность на 11 сутки культивирования составляет 8,0 ед/мл или 160 ед/г субстрата. Таким образом, штамм - продуцент Aspergillus heteromorphus Batista et Maia BKM F-3010 Д синтезирует в 1,3-2,2 раза больше целлобиазы по сравнению с лучшим из известных продуцентов целлобиазы Aspergillus awamori F-122. (56) Авторское свидетельство СССР N 1267782, кл. C 12 N 9/42, 1986. Авторское свидетельство СССР N 1426091, кл. C 12 N 1/14, 10.02.87. Авторское свидетельство СССР N 1440022, кл. C 12 N 1/14, 19.03.87.

Формула изобретения

Штамм гриба Aspergillus heteromorphus Batista et Maia BKM F-3010 Д - продуцент целлобиазы.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 17.04.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 15-2003

Извещение опубликовано: 27.05.2003        

---