Способ определения активности изопероксидаз

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и биологической химий и может быть использовано для изучения структуры и функции ферментов, а также для разработки экспресс-методов диагностикисостояния растений, животных и человека. С целью повышения избирательности и чувствительности определения, электрофоретическое разделение белков из вытяжки пероксидаз , полученных из проростков пшеницы и кукурузы, осуществляют на 2-х параллельных дорожках в полиакриламидном геле толщиной 1 мм. Полученную гелевую пластинку разделяют на 2 части таким образом, чтобы параллельные пробы оказались в разных половинах геля, одну из которых обрабатывают 30 мин в 0,02%-ном бензидине солянокислом, приготовленном на 0,1 М ацетатном буфере рН 4,7, а затем до появления синих полос в 0,1%-ном растворе перекиси водорода. Другую часть геля окрашивают на белок серебряным реагентом, после чего обе половинки геля десинтометрируют и определяют содержание белка и удельную ферментативную активность в каждой электрофоретической зоне по площадям пиков. Преимущество способа заключается в упрощении определения активности изопероксидаз за счет исключения многоэтапной очистки и получении информации об удельной активности каждой изопероксидазы, входящей в состав многоком.понентной смеси изоферментов из вытяжки проростков растений. 3 табл. SP СЛ

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (111

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ ld ОТКРЫТИЙ (21) 4091386/28-13 (22) 18.07.86 (46) 15.09.88. Бюл. № 34 (7I) Казахский научно-исследовательский институт земледелия им. В. Р. Вильямса (72) И. М. Савич, Ю. В. Перуанский и Т. Л. Тажибаева (53) 577.15 (088.8) (56) Бояркин А. Н. Быстрый метод определения активности пероксидазы.— Биохимия, 1951, т. 16, № 4, с. 352 — 357.

Кабжанова С. Б. и Перуанский Ю. В. Состав и активность изозимов пероксидаз и эстераз зерна гетерозисных гибридов кукурузы.— Вестник сельскохозяйственной науки

Казахстана, 1975, № 9, с. 33 — 37. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ИЗОПЕРОКСИДАЗ (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и биологической химии и может быть использовано для изучения структуры и функции ферментов, а также для разработки экспресс-методов диагностики состояния растений, животных и человека. С целью повышения избирательности и чувст(5D 4 С 12 N 9 42 G 01 N 33 48 вительности определения, электрофоретическое разделение белков из вытяжки пероксидаз, полученных из проростков пшеницы и кукурузы, осуществляют на 2-х параллельных дорожках в полиакриламидном геле толщиной 1 мм. Полученную гелевую пластинку разделяют на 2 части таким образом, чтобы параллельные пробы оказались в разных половинах геля, одну из которых обрабатывают 30 мин в 0,0200-ном бензидине солянокислом, приготовленном на 0,1 М аце-татном буфере рН 4,7, а затем до появления синих полос в 0,100-ном растворе перекиси водорода. Другую часть геля окрашивают на белок серебряным реагентом, после чего обе половинки геля десинтометрируют и определяют содержание белка и удельную ферментативную активность в каждой электрофоретической зоне по площадям пиков. Преимущество способа заключается в упрощении определения активности изопероксидаз за счет исключения многоэтапной очистки и получении информации об удельной активности каждой изопероксидазы, входящей в состав многокомпонентной смеси изоферментов из вытяжки проростков растений. 3 табл.

1423587

Таблица 1

Расчет удельной активности анодных изопероксидаз проростков кукурузы

Днепровский 247 МВ

S пика (мм ) H/N

S пика (мм ) при окрашивании на белок серебрением

Удельная активность. пкат, мкг

ОЭП изозима

Количество белка, мкг

Актив— ность (пкат) при проявлении на активность изо пероксидаз

22,70

14,68

17,90

22,76

1,63

1,37

31,08

27,45

37,57

28,90

1,70

1,87

2,? 5.

1,49

2,56

2,1

2,04

1,50

1,27

1,57

П р и м е ч а н и е. S — площадь пика", пкат — пикокаталы, ОЭП вЂ” относительная электрофоретическая активность.

Изобретение относится к молекулярной б!иологии и биологической химии и может оыть использовано для изучения структуры и функции ферментов, а также для разработки экспресс-методов диагностики состояния растений, животных и человека.

Цель изобретения — повышение избиральности и чувствительности определения.

Сущность изобретения заключается в том, о после электрофоретического разделения полиакриламидном геле удельную активость изопероксидаз и содержание в них лка определяют десинтометрически после бработки соответствующими реагентами и асчет удельной активности проводят на осове калибровочных графиков, построенных о стандартному препарату пероксидазы.

Пример !. Навеску 0,2 г растительного атериала растирают в 1 мл холодного трисицинового буфера, рН 8,3, содержащего

0% сахарозы, в фарфоровой ступке в теение 3 мин, выдерживают в холодильние (4 — 6"С) в течение 30 мин и центрифугиуют при 10000 g в течение 20 мин. Полученную вытяжку используют для электрофоретического разделения изопероксидаз, В карман геля наносят строго определенное количество белкового материала (в пределах 25 — 35 мкг). После электрофореза гель разрезают так, чтобы две пробы одного и того же образца оказались в двух разных половинках геля. Одну из них выдерживают 30 мин в 0,02%-ном бензидине солянокислом, приготовленном на 0,1 М аце10 татном буфере, рН 4,7, а затем до проявления синих полос в 0,1%-ном растворе перекиси водорода. Другую часть геля окрашивают на белок серебряным реагентом. Затем обе части геля сканируют с помощью лазерного денситометра и рассчитывают площадь получаемых пиков. По калибровочным графикам, составленным по стандартному препарату пероксидазы из хрена, определяют активность каждого изофермента в пикокаталах, а также количество белка в мкг в зонах, проявивших пероксидазную активность с последующим расчетом удельной активности в пикокаталах на мкг белка (табл. 1, 2, 3).

1423587

Таблица 2

Расчет удельной активности ансдных изопероксидаз листьев озимой пшеницы Альбидум 114

S пика, мм, при окрашивании на белок серебреS пика, мм при проявлении на

ОЭП изозима

¹¹ п/п

Активность (пкат) Количество белка, мкг

Удельная активность, пкат, мкг-» пероксидазную активнием ность

1,12

2,10

11,56

41,45

15,31

1,75

2,10

1,20

1,05

1,84

2,66

2,17

15,05

2,00

2,4

2,93

1,50

2,00 I 65

16,64

П р и м е ч а н и е. S — площадь пика, пкат — пикокаталы.

Таблица 3

Соотношение относительной активности и удельной активности изопероксидаз

7. и к их сумме

Кукуруза

Пшеница

ОЭП изо- Относитель- Удельная ОЭП изо- Относитель- Удельная зима ная зима ная

22

46

40

16,64 риламидном геле с последующей оценкой результатов, отличающийся тем, что, с целью

45 повышения избирательности и чувствительности определения, полученную гелевую пластинку разделяют на две части так, чтобы параллельные пробы оказались в разных половинах геля, одну из которых обрабатывают реагентом для выявления зон фер50 ментативной активности, а другую прокрашивают на белок серебряным реактивом, после чего обе половинки геля десинтометрируют и определяют содержание белка и удельную ферментативную активность в каждой электрофоретической зоне по площадям пиков.

Преимущество предлагаемого способа заключается в упрощении способа определения активности изопероксидаз и активности каждой изопероксидазы, входящей в состав многокомпонентной смеси изоферментов из вытяжки проростков растений.

Формула изобретения

Способ определения активности изопероксидаз, включающий инкубирование проб в растворах субстрата и перекиси водорода, электрофоретическое разделение в полиакВНИИПИ Заказ 4607/30 Тираж 520 Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

24,86

21,96

30,06

23,12

20,33

43,52

33,23

36,13

27,46

29,08

18,81

22,94

29,16

12,60

27,10

20,70

22,50

17,10

11,56

41,45

15,31

15,05