Рекомбинантная плазмидная днк р1емз, кодирующая синтез в- субъединицы холерного токсина, способ ее конструирования и штамм бактерий viвriо сноlеrае - продуцент в-субъединицы холерного токсина
Изобретение относится к биотехнологии , медицине и ветеринарии. Целью изобретения является получение более продуктивного продуцента В- субьединицы холерного токсина. Сконструирована рекомбинантная коньюгативная плазмида р1ЕМЗ в результате объединения с помощью 151-злемента, введенного в состав коньюгативной плазмиды plEMI, двух плазМИД plEMI, производной коньюгативной плазмиды рОХ38. маркированной минитранспозоном с геном резистэнтности к t анамицину(Кт и рСТ 27. прс1 1водной pBR 322. несущей в своем сосгапе клонированный ген vet В и маркер резистентнести к тетрациклину (Тс ). Путем конью1ации плазмида р1ЕМЗ перенесена из штамма Е. coli К 12 в штамм V. cholerae С197 не-01 группы. Среди отобранных трансконьюгантов в1-.|делен ьитамм КМ93, утративший маркер Kft коньюгативной части коинтеграта. отлич юц .ийся повышенной резистентностью к тетрациклину , стабильным сохранением этого признака и способностью эффективно продуцировать В-су6ьединицу холерного токсина в количестве 10-11 мг/л культуральной среды. Способность (лтамма КМ93 к экзогродукции В-субьединицы холерного токги на определена с использованием трех методов: реакции пассивною иммунного гемолиза на чашках, иммуноферментного метода ELISA, титрации препарата в кожной пробе по Крейгу. а такхе в производственных условиях при выращивании штамма в реакторе. Показано, что штамм КМ93 не патогенен для крольчат-сосунков в дозе 10 -10 микробных клеток и не вызывает накопления жидкости в тонком кишечнике взрослого кролика 3 с.п.ф-лы. ся о ел о ю ю
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРБ»ТИЯМ iiP 1 ГКНТ C.".CP ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (/1 f (» (Л »С) Crt C) ;21) 4307009/13 (22)»8.09.87 (46) i5.10.91. Бюл. l+ 38 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им, Н.Ф. Гама еи и Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт "Микроб (72, T.Ñ. Ильина, Г.Б. Смирнов, Н.И. Смирнова и il.Ф. Лива»»ова (53) 575." 24 " b 7.2(0 -!8)(088.8;» (бб} Янишезский Н,Е!. и др. Молекулярная гене1ика 1387. л». 1, 26 — 34. (54, РEKOMF.ÈНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК Р ЕМЗ, КОДИРУКЗЩАЯ СИНТЕЗ В .:УБ»- ЕДИНИ»ЦЫ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА, СПОСЗБ ЕЕ КСНСТРУИРОВАНИЯ И ШТ М Л БАК, ЕРИЙ ЪВК!О CHOLERAE— П РОДУЦЕ HT В-СУБ Ь ЕДИ Н ИЦЫ ХОЛ Е РНОГО ТОКСИН,": (57) Y çoáðåråíèå относится к биотехнологии. медицине и ветеринарии. Целью изобретения является получение более продуктивного продуцента В- субьединицы холерного токсина. Сконструирована рекомбинантная коньюгативная плазмида plEM3 в результате объединения с помощью IS1-элемента, введенного в состав - коньюгативной плазмиды plEM1, двух плазИзобретение относится к биотехнологии,медицине и ветеринарии. Целью изобретения является получение более продуктивного продукта В-субьединицы холерного токсина, С помощью генетических методов сконструирована конью»ативная плазмида „„. Ы „„1505022 А1 мил — plEM1, производной коньк гативной плазмиды рОХ38, маркированной мини-,pýíñïoçoío÷ с геном резистентности к »анамицину (Кп» и рСТ 27, прс1 -.âoäíoé p BR R) 322, несущей B своем cocrà»»e клонированный ген vcr В и маркер Г»езистен1ности к тетрациклину(Тс ). Путем конью»ации плазR мида р1ЕМЗ перечесена из штамма Е. со»» К 12 в штамм V chnierae С197 не-01 группы. Среди отобранных трансконью»антов выделен штамм КМ93, утратившии л1аркер I:r»» коньюгативной части коинтеграта, отличэюU»ийся повышенной резистентностью к тетрациклину, стабильным сохранением этого признака v: способностью аффективно продуцировать В-субьединицу холернс го токсина в количестве 10-11 м»/и купьтуральнои среды. Способность и»там»ла КМ93 к зкзопродукции В-"убьединицы холерного TOKc » на определена с использован: ем peõ методов: реакции пассивно» о и»лм) нного гемолиза на чашках, и»лмуноферл1еíTíoãо метода ELISA, титрации препарата в кожной пробе по Крейгу, а такыре в производственных условиях при выращивании штамма в реакторе. Показано, что штамм КМ93 не патогенен для крольчат-сосунков в дозе 10 — 10 микробчь»х клеток и не вызы9 10 вает накопления жидкости в тонком кйшечни»,е взрослого кролика 3 с.п.ф-лы. plEM — 3, представляющая собой коинтеграт плазмиды plEM — 1 с плазмидой рСТ Л27, несущей клонированный ген чст В, детерминирующий синтез В-субьединицы холерного токсина, и в результате коньюгативного введения сконструированной плазмиды plEM — 3 в клетки штамма Vibrio cholerae ".е1505022 01 группы создан штамм V, cholerae KM93 не-01 группы, который является новым штаммом — продуцентом В-субьединицы холерного токсина. Пример 1. Получение коньюгативной плазмиды plEM3, несущей ген vct В (В-субьединицы холерного токсина). ГЬазмиду рОХ38, являющуюся производной Е-фактора. который утратил все известные IS-элементы, маркируют мини-транспозоном, несущим в своем состане ген резистентности к канамицину. Такой транспозон дефектен по транспозиции L:, другим рекомбинационнь>м событиям, гвязаннь»л с транспозонами. Другой подв>1жный элемент IS1 вводят в ту же плазмиду методом транспозиции. В результате сконструированная плаэмида р!ЕМ1 соус рж>1т маркер канамицинрезистентности (Km ) и IS1-элемент, способный обеспе>ить образование коинтегратов с неко»ьюгативными плазмидами, содержащи>ли клонированные гены. Плазмиду plEM1 совмещают с плаэмидой ОСТ Л27 (11, несущий ген vct В, в клет>.ax шламма F.coli НВ101 рго leu recAr m . Г!опученные клоны используют в коньюгационнь>х скоещиваниях в качестве доноров. i åLLènL1åí Toì используют штамм Е.coll K I2P3470 ро!А. В клетках такого реципиенга плазмида рС Г Л 27 может существовать .Олько EI составе коинтеграта, образованно> о зэ с >ет гранспозиционного акта IS1-эле>le>Ita, госкольку для ее репликации необходи> продукт polA-гена. Поэтому сре»1 отобранных Tc KITl клонов трансконьюR R >антов штамма Р3478 большинство тех, > ст рые уHPcëeäoâaëè рекомбинантную лазмиду — коинтеграт двух плазмид р! ЕМ1 и рСТ Л 27. Доказательство слияния двух плазмид полу ают при следующих актах конь огационных скрещиваний, когда прН отборе по одно>лу из маркеров. например Тс, наследуется и неселектируемый марR кер Кm, практически в 100 случаев. Рея >,омбинантная плазмида, в которой обьеди е>».> две плазмиды — коньюгативная р Е1".1 и»еконь>огативная рСт Л27 с геном vct В, названа плазмидой р1емЗ, Она стабильно сохраняется в клетках Е. coll K12 в виде коинтеграта. Пример 2, Создание штамма V. cholerae KM93 не-01 группы. В клетки НАГ-вибриона С197 коньюгат. вным путем вводят коинтегратную плазмиду plEMÇ, состоящую из двух плаэмид РО7<38 (мини-Km) и рСТ Л 27. Полученные i рансконь>оганты вибриона, содержащие пла.3миду р! Е МЗ, Km Тс, и продуцируют В-субьединицу xnlle>7»ol >оксина, ч>О опр>.— деляют реакцией плгсивного ик мунного гемолиза на плотной среде (РПИГ). Поскольку создан» ые Tpa>IcKo>Ib>ol a>3 гы V, choleIae С197/р!ЕМЗ содержат лишь одну-две копии клонированно>О гена vct В, так как коинтеграт plE MÇ является малоко l>1>1 ной плазмидой, то для увеличения кпп>л>1 Io сти генов vct Ь с целью ппв lluelll>R продукции В-субьединицы, на вторю. 7 ",rle >< получают клоны вибриона Km ТС, которые после разьединения двух репликонов pQX38 мини-Km и рС ГЛ2" и /трать> плгзми ды рОХ38 мини-Кгп и рсТЛ27 и утра1ы пла миды рОХ38 мини-Кп содержат лишь многокопийную плаз>1иду рСТ Л 27, солер R жащую гены Тс и vct В Один а аких S R Km Тс клоно>3, проявляющий ус ойч>1вость к повышенным концентрациям 1етрацпклина (20 — 40 мкг/мл1 I1 продуцирующий 10 11 мкг/мл культуральной среды В-субьединицы холерного токсина, выбран в качестве штамма-продуцента этого белка и бозна чен V. cholerare KIVI93 не-01 группы. Характерис >.1ка штамма КМ93. Ото бранный штамм, получивший nàзean лэ VIt7rlo choleraIe KM93 не-01 группы. Lxсгге дован на патогеннь>е свойства Он >I» вир,,— лентен для крольчат-сосунков в дозг. 10 -10 микробных кле1ок, не вь;эь>вэет >Ia9 10 копления жидкости в тонком киш-"чнике взрослого кролика. Культурально->лорфологичес <ие lp>1знаки шт; >лл1а KM93 — подвижные грак1отрицательные палочки. Штамм хорошо рвете.> на простых полноце ных средах и средах с тетрациклином (20 >лкг/к1л) При пог еле в жидкие среды вызываег равномерное помутнение бульона. Для роста на ми«ималь ной среде нуждается в poáà>3ëå>IL1> аденина, Не способен продуцировать гемолизин (hly ), ФизиологичесK>1e свойства — относ.1тся к I группе Хайберга. Не лизирует Зритроци ты барана, где агглк7тинирует куриные эритроциты. Чувствителен к полимиKcèíy Резистентен к холерным диагногти IecK>1I1 фагам С, эльтор, ХДФ 3, 4, 5. 1y>3..т.,ителен к фагу ТЭПВ 2, использусмо>лу для фа><>т>л пирования энтеропэтогеннь х НАГ-в 1брио нов. Пример 3. Определение продуктивности штамма V.cholerae КМ93 н>.--01, оуппы в отношении В-субьединиць; олерного ток сина. Высушенную ампульнy>o кул>,>;r у штамма КМ93 высевают >la агар Xo;IL1>>reit рН 7,6 содержащий 10 мкгlмл тетрацикл на, и инкубирук7т 19 ч при 37 С. В качес.l;e контроля использукзт исходный штамм V 1505022 c hole! Be С197 >(е-01 rpynni i;) т акже т(. этиг бензтиазолин-6-сульфанат). Через 30 cholerBe 569В в качестве этап,н (ого IUTBM- мин экспозиции np(1 комна(ной те(1перлтумл — продуцента холерного то:сина. ре при постоянном Встряхивании измеряют Колонии штаммов С197, КМ93 и 569В оптическу>о плотность раствора при 405 нм. переносят методом реплик на чашки с 1% 5 Чувствительность метода в данной серии ным отмытым синклзным BrBpoM, содержа- опытов составляет 1 нг. В соответствии с 1 p) щим 1 г, отмытых в синкля> ом бульоне установленной чувс) виre, ыностью и r>о Ф% ЗрптрОцй>СВ бар; Л .".ОСЕВЫ И>>КубИруК т 18 СНЕтОМ ЧИСЛЯ ВЫро-LL>(1X В ПрОцЕССЕ КуЛЬтИ(: пр>1 39 С .лл>,:вак>т Сгибе.1 0,5% синказно- вирс!Вания I Ièê(3oáíû)< клеток рассчитывают (О ."-глгя, содержа..еro азид натрия, Koiипле- 10 >родукцию В-субьедин>>цы холерногÎ ток5",ni)cl .й св1нки и мс;-орецепторную ина (UTBMMcM l 3 г .)ТО (;ч г.- у осыворо vy. Через 1 — 2 I Bl=l LLI MM КМ93 син)ез(;l)óeò 10- 11 л1г В-субь") / р"-. I i влч 1> nfl, .7 С учитывают результл .".-(>;: >Иць> на 1 л iv))b Tyl л(>!,но(й средь, штлктл1 Е )>;3) г .".>лкро 0>ioiiий ско> (>руирован >0;О 5() :)>> взятый как про lyUO,>т колер(>ого ток ((>fBMfi,-" КМ93, прод,ц>р >о це 0 B-субье.".,- 5 (и B — 0 м;i nf, у ис. Одног(> штамма С197 н >ц,<олер>«зго токсинл набг>од кзт че, кую редукция В-субьед.1чицы равна О, зону "еf10лизл размером 1-5 мм. V исход.iî- g >я >од-верждсн. я того, что штамм го (> .лм(1л С,197, че Hecy!U()ro i:лазм.,;ы, K,"193 продуцирует лишь В-субьедин(1цу хоT 1TcTrfyeT. >;0Kp ff I4BKp(! 3,ieph10r(3 ToKch1ffB, BKTlIBfIocTb BToro белка 1 лсн>1й iii!B(1MB 5((В. продуц(>р;(o fle!(.: "О- (!;)зучэют В кожной пробе по,peery. В качел(-рч.>й ток(.nf, так>кe >1«ее гся ." ° нл с яе контроля помимо исходного штамма ем >л >за за счет взл«модействия В-с, бь С197 используют сконструирован ныи еди»ь»(-> хплепhioro токсиiie с сooTeeTCTB tf)- штамм с197 (pc0107). npr ду (ирующий хоь! Ими Pнт>:; c(> мн В лн > (1 Гоксичн,,й ле>)н.яи пкси 1, Обре>зовлние k()ro )ОГÎ кодиi 25 р)ется генами Vct А. В, клонировлнными в Для кол>1iecrвечного определения В- (ос)аве плазмиды, Установлено, что полосy ьef;I„ нь х" легч лагг r()kci:»In испол,"г - .ительная реакция (образован(>е плпул разlirln 1 !)ВР >,i таз - . 1 1 1" ноф()l-)(е>IT(1 : г. 1е ро;т 10 MM зл счет действия ;>(ЗТОД. Ь VB×ÅCòee КОН(РОЛ.) И ДЛЯ OnPeÄe .Е- й-cyhbe)ИНИЦ(>, В РЕЗУЛЬТBIV КОТОРОГО ИЗМЕн >я >увствительност - метода спользовлли . ." . Яется проницаемость сос дов) имеет место ) очищенный преплрлг <олерного токсина лишь в слута(использования штамма С197 ))còkè liiiBMI 3 КМ93 в О()ьеме 5 л выра(ци- (рСО 07) гродуци(зующе>.> холерный Т0Кт ОО; BBni> 1З « ippi130, !3.:p())e -(д-.р f 1 экст>)акга и 3 . I 7.г,. К)еTh .. осл «äBLOT Ui. H- 5 р;-зведен(l1 их суп Онатлнт()в не дают полото(>фу(и!" Влн(10 ->. В су ер !лтлчте onpen - ">< ef:.I. ной ре >кции. )> Я >от кол,> >(."ство I . - C /6))-.(Äè H " .(hl лолерн )! .) (.!,()coá. >OcT ü ill i B .1 ма М".3 п I)0>(y(g(1poтоксина, (е Ic 16! 1I13BUhfk> м >knonëBT п(>0 вл ь В-субьеди "ицу колер-I„ro токсина npoI3 >g,ÿ) (>очокло> альчь>ми >тммуноглобуличл веряют также при выращ(>влнии el 0 в I ми клл.с; (з(, к I3-:-..óábåäníèöå хот>ерногс 40 р B;rope, т.е. в произвг)дств(.нных условиг rnKcHhiB, d лунки микропллт вносят по 100 Я<. Определение количест()л B-субьединицы ;>кл рлст в(3(за моно лона льны х антител ь В кульгур льных. филь грах реакций плссив0,01 М на > рий-фосфлтно(буфере (I=BS) р>ч чои гемл г-,к)тинации пок; зало, что в случае 1,4. I3 ко <центрации 10 мк! /мл, инкубирую) ш гамма КМ93 В-субье,)иница Koneofioro 1 т 70(° О i ч при 3, С и оставляют нл ночь при -, (.. 45 (О.сина регист()ироваллс> п(зи (>cnonf,зонаЗатем пласт>1ны промывак)т эти(. бзу(Ьером нии разведения +ильтра л 1.1280, в то вре Г) с 0,05, твин-), (r é:ýl), sb!cyL(l(1( KR()ii-:ль lbie зн гитела, меченны:- антибиотикoB в течечие 13 ч 98% клонов пероксидазой в рабочем разведении 1:400. сохоаняют маркеры Тс и способность к Коньюгаты анти ел с пероксидаэой получе- 55 прод>кции В-субьеди il цы 3ти заданные ны периодатны > методом. После инкубации сзидетельствуют о abfcok()I1 с»,сильности пластин шестик лтнп npoM>lf)B>oT PBST и в штамма КМ93 — продуц нтл В-с,(зьединицы. ка»(ду>(лу(fk". д(бэвляют субс rpBI — 0 3% — Добавление В среду f» >г )il, и.".)Itl". т .трацикную п>Орехи ь водорода в 0,05 М лимонной )>ина(5мкгlмл) обеспеч. >,> - 1(>(, g -ну>остак>»сг«те;3(1 4,0 и 0,0005 М 2,2 -азиноди-(3- бильность штамма (г> > и от»ошении 1505022 С О с. l,э, ) ) ) г с !l h ) с; ) " ), э -: °,)с)л ) л "" )Г)г - -с) ):л) Р-.,;актор Л Г1ас) loca 1 () . Г)с: с p M М эк)„имишинец Подписн(, . 1с .ниям )1 ol крь) ) с) я)м при ГKНТ СССР с кл) н,)б 4!5.:а),эз 4594 Тир lix ВН11с4)Г1И Государе)()еi)i)oio ком) ) г,) пг) э()б; с 1130.3 ., М()ок.«l, -:, 35, Н ) ó,) Про)1эеодс твен но изда ) ел ьский Yo)1) )!, )) Г1 l l с . ) с, Г, у+,)Г)ОД, у!i. Г а Гарина, 101 "., èíòåçà В-субьединицы, так как в данных условиях размножаются лишь те клетки, в которых содержится плаэмида рСТ Л 27 с геном Тс и vct B. Выращивание штамма Ес ,М93 в производственных условиях в среде с добавлением тетрациклина и последующая проверка полученных изолированных колоний на продукцию токсина с помощью РП11Г показала. что все изученные 1500 колоний являются Тс и продуцируют В-субьR едИницу. Таким образом, результаты, пол), ченные при лабораторном и пооизводственном испь)тании штамма на сгабильность синтeза В-субьединицы четко показывают, что выращивание штамма е среде с тетрациклином обусловливает 100%-ную стабильность этого признака. Таким образом, сконструированный ()тамм Ч. cholerae КМ93 не-01 группы является продуценго)л В-субьединицы холерного токсина, секретирующейся ео внешнюю среду, Шта)лм КМ93 может быть использован в качеств). производственного штамма для получения иммуногенного В-субьединичн Jãо комплекса, и рименяе лосо для создания диагс остических и профилактических препаратов против холеры. ©cpr ула изобретения 1. Рекомбинантная плазмидная ДНК р1ЕМЗ, кодирующая синтез В-субь ди) ицы . олер)со) о —.îêñèíà ) ° о;) )л 44 МДа и раз. )ером б7.9 т.п.н, содержащая плазмидную ДНК вектора рС) Л27 рамepGM 9,6 T "l н C са)) la!1)1 р",ctp).>!1 ;) один .1а I, два Pst I, три Н1пс!1, ДНК трансмиссиеной плазмиды plEM1 размером 57,5 т,п,н. с саитами рестрикции — один ho I, шесть Есогс 1, один Pst I h IS1-элементе плазмиды plEM1; 5 дополнительную копию IS1-элемента, возникающую в процессе коинтеграции составляющих плазмид, размером 768 п.н, с сайто рестрикц1и Pst I; чс;  — ген, пбеспе)иеающий синтез В10 с. бьединицы холерного токсина; ет С вЂ” ген, обеспечивающий резистент)4ocT) к тетрацик)! .ну, kan — ген, обеспечивающий розистент-)(сть к канал1ици»у; 15 круг хозяев — штаммы Escherlchia coll .,12 .; I iаrlO ChOIerae 2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рlЕМЗ, кодирующей синтез В-cóáüeä) ницы холерногo 20 .оксича, заключан)щийся е том, что штамм Е coll К12 Н В101 recA, несу,ций две автономные г)/)азмиды рСТ Л27 и pIEМ1, иэ которых последняя обладает трансмс ссивными свойствами. скреп)ивают посредством коньюга25 ции со штаммом F, coll К12 Р3478 pol А, е котором плэзмида рСТЛ 27 не способна реп:)и.1ироеаться автономно. отбирают клон )) R Тс Ксп, содеожащий тр; нсмиссивную ое,())4:5и)1a))T))у)о плаэмиду, oбраэующуюсSI 30 путем обьединения двух исходных плазмид =а счет транспозиции IS1-эле.)ента с образовани- л коинтеграта. З,Г,. ). м бактерии Vlb) )o cho егае КМ 93 35 ))() ),",уц.-нт В-субье,,ис)ицы холерно) о ток 1,) ).
