Способ культивирования клеток человека и животных

 

Изобретение относится к клеточной биологии, а именно к выращиванию клеток в культуре, и может быть использовано в вирусологии и биотехнологии для получения клеток в больших количествах. Целью изобретения является уменьшение себестоимости за счет использования отходов молочной промышленности. Для этого культивирование клеток человека и животных проводят в питательной среде, содержащей в качестве ростового фактора концентрат сывороточных белков молочной сыворотки, полученный ультрафильтрацией, или смесь концентрата сывороточных белков молочной сыворотки, полученных ультрафильтрацией, с сывороткой крови крупного рогатого скота в соотношении (5-20):1. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5D 4. С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21 ) 4114595/31 — 13 (22) 08.09.86 (46) 15,09.89. Бюл.N - 34 (71) Институт молекулярной биологии

АН СССР (72) В.M.Áoðoäèíà, Л.И.Федорова и А,В,Зеленин (53) 578.085.23 (088.8) (56) .Serine А., Baserga R., Roubine

grouth of sell lines in medium supplemented with milk instead of serium. — Cell ° Biol. Internat. Reports, 198 I N 5, 339-34$

Заявка США N - 4440860, кл. С 12 N 5/00, 1981 ° (54 ) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК

ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к клеточИзобэетение относится к клеточной биологии, а именно к выращиванию клеток в культуре, и может быть исполь зовано в вирусологии и биотехнологии для получения клеток в больших количествах.

Цель изобретения — уменьшение себестоимости за счет использования отходов молочной промышленности.

Для приготовления среды используют отход молочной промьппренности— концентрат сывороточных белков, полученный методом ультрафильтрации (КСБ/УФ) и содержащий, мас.7: сухих веществ не менее 96,0, в том числе

„„SU„„1507790 А 1

2 ной биологии, а именно к выращиванию клеток в культуре, и может быть использовано в вирусологии и биотехнологии для получения клеток в больших количествах. Целью изобретения является уменьшение себестоимости за счет использования отходов молочной промьппленности. Для этого культивирование клеток человека и животных проводят в питательной среде, содержащей в качестве ростового фактора концентрат сывороточных белков молочной сыворотки, полученный ультрафильтрацией, или смесь концентрата сывороточных белков молочной сь1воротки, полученных ультрафикацией, с сывороткой крови крупного рогатого скота в соотношении (5 — 20):1, 3 табл. азотистых веществ не менее 55 0 в том числе лактозы не более 0,3. Киспотность восстановленного до массовой доли сухих веществ 9,6 7. ОТ концентрата, не более 28, индекс растворимости не более 0,3 мл сырого осадка. .Массовая доля солей тяжелых металлов: меди в пересчете на медь не более 0,0008, олова в пересчете на олово не более 0,005 7, белки не менее 55,0 7, соотношение альбумина, глобулина и казеина меняется, рН 6,3.

Готовят 17 — ный раствор КСБ/УФ на дистиллированной воде, фильтруют

1507790 (фильтры Millipore типНА 0,45р и или

Nucleopore Corp. 0,4 нп, 25 mm).Фильтрат используют в качестве добавок к питательным средам. В некоторых случаях белки сыворотки мопока полностью заменяют сыворотку крови

Крупного рогатого скота (в концентрации 10-15 %), в других случаях необходимо,цобавление 0,5-1% сыврротки

Крови, Оценка пролиферативной активности клеток, растущих в питательных средах с белками молочной сыворотки.

Кривые роста. 15

Суспензию клеток (мышиные фибробласты, штамм 1. Hele o(3 концентрация

2 10 клеток (мл) высаживают по 0,5 мл в ячейки 24-ячеечных пластиковых

Культуральных плат, инкубируют в 20 питательной среде Игла с 10% сыворотКи крупного рогатого скота в течение

3 сут, Через 3 сут среду заменяют

Новой питательной средой, где в качестве ростовых факторов используют 25 белки сыворотки молока или КСБ в различных концентрациях, В дальнейшем смену среды в ячейках проводят каждые 3 дня в течение 15-1Ъ суток.

Клетки снимают трипсином (0,25%) и 30 подсчитывают в камере Горяева.

Используемые клетки растут и размножаются при культивировании их в средах, содержащих только молочную сыворотку или КСБ в течение 15 суток. 5

З

При добавлении 1% сыворотки крови к средам, содержащим в качестве ростовых факторов молочную сыворотку или

КСБ, темпы роста клеток выше, чем при: инкубации их только с 10% сыворот!!<и кр и

Синтез ДНК.

С помощью метода проточной цито флюориметрии (EPIC у — У} изучают распределение клеток культур, растущих в питательных средах с белками сыворотки молока в качестве растового фактора, по фазам клеточного цикла (G„+G,у, G,+М}. Мышиные фибробласты, штамм I, и клетки миеломы. Х63 — Ag

8-653 инкубируют в матрацах (исходная концентрация 8 104 клеток/мл, в среде Игла с 10% сыворотки крови) в течение 3 сут, Затем прочзводят замену в питательной среде сыворотки крови

10%-ной сывороткой молока, В дальней— шем осуществляют смену среды, содержащей сыворотку молока каждые три дня в течение 12 сут. Для иссследования клетки снимают с помощью трипсина, суспензию центрифугируют, отмывают средой без сыворотки„ фиксируют в 70 спирта, окрашивают бромистым этидием (конц, 5 мкг/мл, обрабатывают

НРКазой 0,5 мг/мл, 30 мин, 25 С), При инкубации Ь клеток в среде с сывороткой молока в качестве ростового фактора отмечают увеличение доли клеток, находящихся в фазе Г,+Ы, по сравнению с клетками, растущими в среде с сывороткой крови.

ДНК-гистограмма культуры клеток миеломы, растущих в среде с сывороткой молока, существенно не отличается от гистограмм культур, растущих в среде с сывороткой крови в течение

9 сут инкубации. В более поздние сроки инкубации отмечают некоторое снижение доли клеток, находящихся в фазах S u G +М клеточного цикла, и . увеличение — в фазе С,.

Авторадиографические исследования

Для оценки пролиферативной активности и интенсивности синтеза ДНКклеток культур, растущих в среде с сывороткой молока, проводят авторадибграфическое исследование. С этой целью проводят импульсную (1 ч, 37 С, 37 КВЧ/мл) инкубацию клеток односуточI ной культуры мышиных фибробластов (l. клеток), Удельная активность

1790 ТВц/моль, После этого .клетки промывают три раза физиологическим раствором, затем материал фиксируют в смеси спирта и уксусной кислоты (3:1) и высушивают на воздухе, Препараты покрывают эмульсией типа И, промывают -1 ч водопроводной водой, обрабатывают 5% ТХУ 5 мин при 4 С, снова промывают водопроводной водой

2 ч и высушивают. На полученных автографах подсчитывают процент меченных Н " тимидином клеток (на з

300 клеток) . Индексом меченых клеток считают отношение числа меченых к общему числу клеток, выраженное в процентах. а

Из табп.1 видно, что включение тимидина в ДНК-клеток культур;: растущих в среде с сывороткой молока, происходит на том же уровне, что и в ДНКклеток, находящихся в среде с сывороткой крови крупного рогатого скота, Дпя оценки возможности активации клеточной пролиферации покоящихся клеток в средах с белками:иолочнай

1507790

Таблица.

Индекс меченных клеток

Среда

Среда Игла с 10% сыворотки крови

39,6 0,3

Среда Игла

0 5Х сыворотки крови +

10% сыворотки молока

40,6 1,9

Таблица 2

Включение Н-тимидина культурой мышиных клеток ЗТЗ

48 72 48

Инкубация, ч

0„5Х сыворотки 20% сывокрови ротки крови

10% сыворотки крови

Ростовой фактор

10% сыворотки молока

Индекс меченых клеток

44,730 7 17 9+0 9 39 0+3,7 31 6+3,3 сыворотки проводят исследования по включению Н -тимидина мьппиными клетз ками 3Т3. С этой целью клетки вначале культивируют в питательной среде Игла с 10% сыворотки крови крупного рогатого скота в течение 48 ч, после чего среду заменяют на среду с 0,5% сыворотки крови, в которой инкубируют клетки 72 ч для снижения клеточной 10 пролиферации.

Для, активации пролиферации покойщиеся клетки переводят в питательную среду с 10% сыворотки молока, В качестве контроля используют питательную 15 среду с 10% сыворотки крови.

Иэ табл, 2 .видно, что клетки, нахо.дящиеся в состояний сниженной пролифе- ративной активности, при переводе их в питательную среду только с белками 20 молочной сыворотки начинают синтезировать ДНК на высоком уровне (индекс включения 31,6Х в среде с сывороткой молока и 39,0% в среде с сывороткой крови КРС), 25

Определение митотического индек са.

Клетки Не1ар3 инкубируют в тече ние 1 сут в пенициллиновых флаконах на покровных стеклах, Наблюдения про- 30 изводят в люминесцентном микроскопе (МЛ-2) после окрашивания клеток флюорохромом .акридиновым оранжевым (конц.

10 M, 5 мин).

Митотический индекс как показатель 3 пролиферативной активности клеток .определяют путем подсчета количества митозов на 1000 клеток (промилин %).

Через 1 сут инкубации клеток Не?ау в среде с 10% молока+0,5% сыворотки 40 . КРС и в среде с 10% сыворотки КРС митотический индекс составлял 48 и 55% соответственно.

В табл.3 представлены результаты, полученные по определению митотиче- 45 ского индекса тех же клеток Не1ар3 при культивировании их в питательных средах с КСБ, Таким образом, по такому показателю как митотический индекс, клетки

C культуры, растущей в питательной среде с сывороткой молока или концентратом сывороточных белков, существенно не отличались от клеток культур, культивируемых в средах с сывороткой крови, Формула изобретения

Способ культивирования клеток че ловека и животных, включающий выращивание посевного материала на питательной среде с ростовым фактором, о т л и ч а ю щ и и с я тем., что, с целью уменьшения себестоимости за счет использования отходов молочной промышленности, в качестве ростового фактора используют концентрат сывороточнь1х белков молочной сыворотки, полученный ультрафильтрацией, или смесь концентрата сывороточных белков молочной сыворотки, полученных ультрафильтрацией с сывороткой крови крупного рогатого скота в соотношении 5-20: 1, Включение Н вЂ” тимидина мьппиными

3 клетками (Штамм 1.) 1507790

Таблица 3

Митотический индекс клеток 11е1ау, при культивировании их в питательных. средах с КСБ

Митотический индекс, %

Варианты сред

Составитель И,Тареева

Техред М ° МоРгентал Корректop Н БоРисова

Редактор Л.Пчолинская

Заказ 5516/29

Тираж 501

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

Среда Игла 11

Среда Игла

lt

10% сыворотки крови

10% КСБ + 0,5% сыворотки крови

15% КСБ + 0,5Б .сыворотки крови

10%. КСБ + 2% сыворотки крови