Штамм лимфоидной клеточной линии человека номо sapiens, используемый в качестве тест-объекта для изучения действия мутагенных, лекарственных и вирусных препаратов

 

Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано в вирусологии и молекулярной биологии. Цель изобретения - получение штамма клеточной линии человека, пригодного для испытания различных лекарственных, мутагенных и вирусных препаратов. Штамм депонирован под номером ВСКК(П)N153Д. Штамм получен при культивировании лимфоцитов периферической крови больного острым монобластным лейкозом. Кариотип клеток в части случаев нормальный, а в части случаев патологический, имеется два маркера, что позволяет использовать штамм как тест-культуру для изучения механизма действия вирусов, канцерогенов, а также лекарственных препаратов. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU, 15130 1 А 1 (59 4 С 12 N 5/00

6::ГИ

11 И !il i! ) !

Е дБ il1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К AВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

-(21) 4387404/31 — 13 (22) 25.01.88 (46) 07.10.89. Бюл. Р 37 (71) Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и терапии АМН СССР и Институт цитологии

АН СССР (72) В.З.Агроба, В.В.Тимановская, С.Е.Мамаева, Л.Ж.Бабаева, С.В.Новожилов, В.В.Какубава и Э.M.Êoâå (53) 578.085.23 (088.8) (56) Agrba V. Z. et al. Exp. Path.

1979, 17, s. 228-236. (54) ШТАММ ЛИМФОИДНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ

ЧЕЛОВЕКА H0MO SAPIENS ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ

В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-ОБЪЕКТА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ

ДЕЙСТВИЯ МУТАГЕННЫХ,ЛЕКАРСТВЕННЫХ И

ВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в качестве тест-культуры для изучения действия различных мутагенных и лекарственных препаратов, а также вирусных агентов.

Цель изобретения — получение штамма клеточной линии человека, пригодного для испытания различных лекарственных, мутагенных и вирусных препаратов.

Штамм ЛС(ОМ)2 получен в 1982 г. от больного острым монобластным лейкозом при культивировании лимфоцитов периферической крови, выделенных путем низкоскоростного центрифугирования в градиенте фиколл-верографин.

2 (57) Изобретение относится к области биологии. и медицины и может быть использовано в вирусологии и молеку" лярной биологии. Цель изобретения получение штамма клеточной линии человека, пригодного для испытания различных лекарственных, мутагенных и вирусных препаратов, Штамм депонирован под номером ВСКК (II) В 153Д.

Штамм получен при культивировании лимфоцитов периферической крови больного острым монобластным лейкозом.

Кариотип клеток в части случаев нормальный, а в части случаев патологический, имеется два маркера, что позволяет использовать штамм как тесткультуру для изучения механизма действия вирусов, канцерогенов, а также лекарственных препаратов. 1 табл.

Штамм лимфоидной клеточной линии

Ното Sapiens депонирован под номером

BCKK(II) Ф 153Д и характеризуется следующими признаками.

Морфологическая характеристика и культуральные свойства. Штамм

ЛС(ОМ)-2 представляет собой лимфоидЬаай ную культуру клеток, которая без су1 щественных изменений фенотипических, морфологических и биологических свойств, размножается в течение 5 лет.

Основной особенностью штамма является его способность пролиферировать в суспензионном состоянии в жидкой фазе среды культивирования без признаков прикрепления к стеклу, активно метаболизируя питательную среду, с высокая активность нафтол AS-ацетатэстеразы, обнаруживаются липиды.

Вирусологическая характеристика.

Электронно-микроскопическая характеристика. При исследовании ультратонких срезов клеток штамма ЛС(ОМ)-2 (приготовленных на ультратоме LKB после фиксации клеток штамма 37.-ным раствором глютарового альдегида с последующей дополнительной фиксацией,контрастированием уранилацетатом и цитратом свин ца) в электронном микроскопе JEN 100 В выявлены частицы с морфологической структурой вируса герпеса в 0,57 клеток.

Изучение изоэнзимного состава клеток штамма ЛС(ОМ)-2. Для изучения изоэнзимного состава лактатдегидрогеназы (ЛДГ).и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) в клетках штамма

10 клеток промывают в растворе Хенкса, добавляют 100 мкл дистиллированной воды, интенсивно пипетируют, и клеточный детрит осаждают при

12 OOG об/мин в течение,10 мин. Надосадок используют для тестирования ферментативной активности. Пробы подвергают ЭФ (электрофорезу) в полиакриламидном геле (77). После проявления ферментативной активности установлено, что в клетках ЛС(ОМ)-.2 ЛДГ пред ставлена 5 изоэнзимами с различными электрофоретическими подвижностями, что характерно для отряда приматов.

Г6ФДГ представлена одним изоэнзимом типа В, характерным для людей белой расы.

Чувствительность к вирусам. Чувствительность клеток штамма ЛС(ОМ) -2 к парамиксовирусам птиц определена на примере вируса болезни Ньюкасла и семейству рабдовирусов на примере виру са везикулярного стоматита, серотип

Индиана. Клетки штамма не выявляют высокой чувствительности к обоим указанным вирусам.

Пример 1. Клетки штамма в среде RPMI 1640 в сочетании с 157. сыво- ротки крупного рогатого скота в количестве 5х10 кл./мл расфасовывают в пробирки по 2 мл. Клетки отмывают от сыворотки, осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение

5 мин и к полученному осадку добавляют по 0,2 мл вируса везикулярного стоматита, серотип Индиана, и вируса болезни Ньюкасла, Контакт вирусов с

Цитохимическая характеристика.

Цитохимический анализ клеток штамма

ЛС (ОМ) -2 выявляет их В-лимфоидную принадлежность, на основании определения высокой пиронинофиллии цитоплазмы присутствия гранул гликогена, Э

55 определяемого по методу UHK (реакция

Мак-Мануса), отсутствия активности пероксидазы и щелочной фосфатазы.

В клетках штамма определяется также

3 1513031 образованием различной формы и величины клеточных конгломератов, видимых невооруженным глазом. Ытамм отличается также простотой культивирования, так как размножается на питательной среде RPNI 1640 с добавлением 157. инактивированной прогреванием бычьей сыворотки, L-глютамина (300 мкг/мл) и антибиотиков в стационарном состоя- 10 о нии в обычном термостате при 37 С.

Время удвоения клеточной массы 24 ч.

Оптимальная концентрация клеток (3-4)х10 кл./мл. Процент живых кле4 ток колеблется в пределах 85-927.. 15

Способ культивирования суспензионный.

Кратность рассева 1:2-1:3 каждые

5 дней. Клетки хорошо переносят криоконсервацию. В качестве криопротектора используется диметилсульфоксид в конечной концентрации 87.

Морфологически штамм состоит из лимфобластов, составляющих 92-957. всей клеточной популяции. Клетки полиморфны, крупные, ядра округлыеили овальные и содержат по одной крупной нуклеоле или изредка две мелкие.

Цитогенетическая характеристика.

Цитогенетический анализ клеток линии

ЛС(ОМ)-2 позволяет выявить наличие модального класса с 46 хромосомами.

Анеуплоидные в основном, гиподиплоид- ные клетки составляют всего 107..

Дифференциальная окраска хромосом на С-диски дает возможность устано- 35 вить, что в пределах одного модального класса имеется два клеточных клона: 2n=46, ХУ (нормальный кариотип) и 2n=46, ХУ, -2, -12, М „, М М

de1 2(р12) и М = E (2; 12), (р12; 40 р13) .Второй клон клеток составляет

207. популяции.

Дифференциальная окраска хромосом на С-диски дает возможность найти общий хромосомный маркер для обо- 45 их клонов — инверсию структурного гетерохроматина в одной из 16 хромосом.

К-0 — — — «100 где К вЂ” количество клеток к

Формула изобретения

Вирус

Количество мертвых клеток, Х, через

Ю

24 ч 48 ч 72 ч 96 ч 120 ч

Вирус везикулярного стоматита

Вирус болезни

Ньюкасла

Контроль

10

33 40

29 32

8 10

20

Составитель А.Маныкин

Техред JI.Oëèéíûê Корректор Л.Бескид

Редактор В,Петраш

Заказ 6043/27 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

5 151 клетками проводят при 374С в течение

1,5 ч, после чего вирусы отсасывают, а к клеткам добавляют ростовую среду.

Опытные и контрольные (вместо вируса вносят питательную среду) пробирки просма гривают ежедневно в световом микроскопе. Степень цитопатического действия оценивают по числу мертвых клеток, для чего ежедневно просчитывают их, смешивая суспензию клеток с равным объемом 0,2Х-ного раствора трепанового синего.

Результаты представлены в таблице.

Как видно из таблицы, клетки штамма не проявляют выраженной чувствительности к указанным вирусам. Это свойство штамма делает его ценным для изучения механизма избирательного действия вирусов на клетки различных штаммов.

Пример 2. Проведено испытание клеточной линии ЛС(ОМ)-2 на чувствительность к антипролиферативному действию рекомбинантного интерферона ю . Клеточную культуру выращивают в среде RPMI с добавлением

10Х-фетальной сыворотки коров; в опы- те используют 1-суточную культуру в концентрации .3 ° 10 кл ./мл. Исходная концентрация интерферона составляет

1 мкг/мл. В 96-ячеечной пластине го3031 6 товят 2-кратные разведения интерферона в среде для выращивания клеток (с 1:2 по 1:128) в объеме 50 мкл, используя по 3 лунки на каждое разведение. Затем в каждую лунку вносят по 50 мкл суспензии клеток. На 3-и о сутки инкубации при 37 С в термостате с 5Х СО клетки подсчитывают в камере Фукса-Розенталя. Процент ингибиции подсчитывают по формуле в контроле; 0 — количество клеток в опыте ° При концентрации интерферона

500 нг/мл ингибиция составляет 70Х при 125 нг/мл — 50Х, при 31,25 нг/мл—

31Х что свидетельствует о высокой чувствительности данной клеточной линии к антипролиферативному действию интерферона. Таким образом, данная линия представляет интерес в изучении механизма антипролиферативного дейст25 вия интерферона.

Штамм лимфоидной клеточной линии че»

3р ëîâåêà Ното Sapiens BCKK(II) У 153Д, используемый в качестве тест-объекта для изучения действия мутагенных, лекарственных и вирусных препаратов.