Способ получения иммуносорбента

 

Изобретение относится к медицине, в чааности к иммумохимик и может быть иаюльэовано для выделе мя с помощью аффимюй хроматографии иммуноглобутмна G, а также FC-фрагментов и иммунных комплексов из крови и других биолсгическихжидкоаей. С целью повышения емкоаи иммуносорбента по связыванию иммуноглобулина G аминопропилсилохром активируют 12.0 13,0%-ным раствором глутарового альдегида, ковалентио связывают с ним бело А из Startiykxxxxus aureus при концентрации последнего в реакционной смеси 3.0 - 6,0 мг/мл с последующей обработкой и промывкой иммуносорбента извеаными способами В результате получают иммуносорбент с емкоаью по иммуноглобулину 23 - 32 мг/г сорбента который может быть использован для выделения иммуноглобулинов не менее 20 раз1

(в) ЯЦ tttI 1 17545 АЗ (51) 61N 3 53

СОКИ СОВЕТСКИХ

СОЯИАЛИСТНЧЕСКИХ 1%СПУВЛНК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО CCCF (ГОСНАТЕНТ CCCF)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 04138744/14 (22) 271036 (46) 15.1293 6ett Йв 45-46 (71) Научно-исстпдоватетъский конструкторскотехнопогичеаае юститут биологичесю4 актиюых (72) Коспве Н.Е; Ярославцев BA (73) НИКТИ БАВ НПО "Вектор (54) СПОСОБ ЙОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОР6ЕНТА (57) Изобретеее относится к медицине, в частности к иммунохиюм, и может быть ислотъзовано для выдепиия с помощью афф9н4ой xpoMBTorp8 иммуноглобулина G, a также F anwanos и евмуных комплексов из крови и других биолсгических жидкостей С цепью повышения емкости иммуносорбента м связьеанно иммуноглобупина G аминопропипсипохром активируют 12.0

13,0%-ным раствором гпутарового апьдегида. к вапентно связываот с не белок А из Starhylococcus

aureus при концентрации пооаднего в реакционной смеси 3,0- 6,0 мг/мп с последующей обработкой и

flpoMblBKoH NhM cop66H18 известными oloc008MK

8 результате получают с емкостью по иммуноглобуъму 23 — 32 мг r сорбента который может быть истюпьзован дпя выделения иммуногпобулинов не менее 20 раз.

1517545

Изобретение относится к медицине, в час-т.,ости к иммунохимии, и может быть использовано для выделения с помощью аффин ной хроматографии иммуноглобулина

G, а также ГС-фрагментов и иммунных комплексов из крови и других биологических жидкостей, Основными характеристиками иммуносорбента являются его сорбционная ем, кость по иммуноглобулину G, устойчивость к воздействию микроорганизмов и фермен. тов, стабильность в процессе многократноГо использования.

Цель изобретения — повышение сорбционной емкости иммуносорбента по иммуноглобулину G.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммуносорбента путем активации носителя, промывки его буферными растворами, ковалентного связывания белка А иэ Staphylococcus aureus c активированным носителем и промывки полученного иммуносорбента буферными растворами, в качестве носителя используют аминопропилсилохром, который активируют глутаровым альдегидом при концентрации 12 — 137ь. а ковалентное свя° зывание белка А с активированным носителем проводят при концентрации его 3-6 мг/мл с последующей обработкой иммунзсорбента известными приемами. г1редлагаемый спо=об выполняется следу ющим образом и включает в себя несколько этапов, 1. Промывка аминопрспилсчлохрома

1,0 M раствором NaCI и дистиллированной водой.

". Активация аминопропилсилохрома (производство Олайнского завода химреак nsoa) глутаровым альдегидом при концентрации 2-13 в течение 2 ч при комнатной температуре и рН 8,0.

3. Промывка активированного аминопропилсилохрома дистиллированной водой и

0,1 M К-фосфатным буфером, рН 8,0.

4. Ковалентное связывание белка А с активированным аминопропилсилохромом с концентрацией белка А в реакционной смеси 3-6 мг/мл в течение 16-20 ч при комнатной температуре и рН 8.0.

5. Промывка иммуносорбента 1 M раствором NaCI и 0,1 M К-фосфатным буфером, рН 7,0, 5. Восстановление свободных альдегидных грурп и стабилизация связи между белком А и силохромом обработкой иммуносорбента 0,1 М раствором NaBH4 в течение 30 мин при 2-4 С и рН 7.0.

7. Промывка иммуносорбента последовательно растворами 1,0 M NaCI. 0,1 М КПример 2. 1. Активацию аминопропилсилохрома проводят согласно примеру 1 при концентрации глутарового альдегида

13,0 в реакционной смеси.

2. Иммобилизацию белка А на аминопропилсилохроме проводят согласно примеру 1 при концентрации белка А в реакционной смеси 6,0 мг/л. Емкость имму55 нссорбента по свиному иммуноглобулину 6 составила 31,7 мг/г. Иммуноглобулин G был гомогенен при дискэлектрофорезе в 7.5 ном полиакриламидном геле.

Пример 3, 1. Активацию аминопропилсилохрома проводят согласно примеру 1

5

45 фосфатного буфера, рН 7,0, 0,1 М уксусной кислоты, рН 3,0, и 0,1 М К-фосфатного буфера, рН 7,0.

Полученный иммуносорбент имеет сорбционную емкость по иммуноглобулину G

23 — 32 мг/мл и может быть использован не менее 20 раз для выделения иммуноглоеулинов без существенного изменения его емкости.

Пример 1. Активация аминопропилсилохрома глутаровым альдегидом.

10 г аминопропилсилохрома последовательно промывают 1,0 М раствором NaCI u дистиллированной водой, а затем вносят в

100 мл 12,5 -ного раствора глутарового альдегида, приготовленного в 0,075 M Кфосфатном буфере, рН 8,0. Реакционную смесь инкубируют на качалке в течение 2 ч при комнатной температуре. Активированный аминопропилсилохром промывают дистиллированной водой для удаления глутарового альдегида, а затем 0,1 M К-фосфатным буфером, рН 8,0.

2. Иммобилизация белка А.

10 г активированного аминопропилсилохрома вносят в 100 мл 0,1 М К-фосфатного буфера, рН 8,0, содержащего белок А с концентрацией 4,5 мг/мл, и смесь инкубируют на качалке при комнатной температуре в течение 17 ч. Иммуносорбент промывают

1,0 М раствором NaCI и 0,1 M К-фосфатным буфером, а затем восстанавливают свободные льдегидные группы путем инкубации иммуносорбента 0,1 M раствором NaBk4, приготовленным на 0.1 М Na-фосфатном буфере, pI.I 7,0, в течение 30 мин при 2 — 4 С.

Иммуносорбент промывают последовательно растворами I,0 M NaCI, 0,1 M К-фосфатного буфера, рН 7,0, 0,1 M уксусной кислоты, рН 3,0, и 0 1 M К-фосфатного буфера, рН 7,0, Емкость полученного иммуносорбента по связыванию иммуноглэбулина G из свиной сыворотки составила 24,8 мг/г. Иммуноглобулин G был гомогенен при диск-электрофорезе в 7,57-ном полиакриламидном геле.

1517545

Составитель И, Башкаев

Техред М,Моргентал Корректор М. Керецман

Редактор Н. Козлова

Заказ 3351

Тираж Подписное

НПО Поиск Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 при концентрации глутарового альдегида

12,0 в реакционной смеси.

2. Иммунобилиэацию белка А на аминопропилсилохроме проводят согласно примеру 1 при концентрации белка А в реакционной смеси 3,0 мгlмл. Емкость иммуносорбента по свиному иммуноглобулину G составила 23,3 мгlг, Иммуноглобулин G был гомогенен при диск-электрофореэе в 7,5 ном палиакриламидном геле.

Преимуществами способа являются: упрощение процесса эа счет исключения из него дефицитного носителя — карбоФормула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОР6ЕН7А, включающий активацию носителя активирующим агентом, промывку буферными растворами, ковалентное связыва ниее белка А из Staphylococcus aureus c

j ним с последующей обработкой и промывкой иммуносорбента. отличающийся тем, нилдиимидазольного производного силикагеля; повышение емкости иммуносорбента в

30-40 раз;

5 расширение воэможности использования иммуносорбента для крупномасштабного выделения иммуноглобулинов и повышения выхода иммуноглобулинов с низкой аффинностью к белку А.

Ф (56) Phflllps Т.М, at el. 1. of Chromatography, 1985, ч. 327, р. 213-219.

15 . что. с целью повышения емкости иммуносорбента, в качестве носителя используют аминопропилсилохром, активацию его осуществляют глутаровым альдегидом в кон20 центрации 12,0 - 13,0 ф. а ковалентное

; связывание проводят при концентрации белка А в реакционной смеси 3,0 - 6,0, мг/мл.