Способ культивирования эмбрионов птиц
Изобретение относится к биологии и может быть использовано в экспериментальной эмбриологии, криобиологии, клеточной и генной инженерии. Цель изобретения - повышение жизнеспособности пересаживаемых эмбрионов и упрощение способа. Для этого используют эмбрионы конца бластулы - начала гаструлы и питательную среду следующего состава, мас.%: сыворотка крови 6-15 эмбриональный экстракт 5-20 солевой раствор остальное. Использование предлагаемого способа по сравнению с известным обеспечивает следующие преимущества: существенное повышение жизнеспособности трансплантированных эмбрионов, упрощение способа и сокращение на 10-20 мин. времени, необходимого для трансплантации 1 эмбриона, расширение области применения способа. 2 табл.
СОЮЗ СО8ЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК (11 4 С 12 N 5/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ
flO ИЭОБРЕТЕНИЯМ И OTKPblTHRM
ПРИ ГННТ СССР (21) 4380291/30-13 (22) 16.02.88 (46) 30.10.89. Бюл, В 40 (71) Украинский научно-исследовательский институт птицеводства (72) Н.И. Сахацкий и А,И, Михайлик (53) 578.085.23(088 ° 8) (56) Кричинская Е.Б., Ефремов В.И.
Методы биологии развития, М.: Наука, 1974, с. 125.
Авторское. свидетельство СССР
Ф 1358872, кл. А 61 К 7/00, С 12 N 5/00, 1986. (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ
ПТИЦ (57) Изобретение относится к биологии и может быть использовано в экспериментальной эмбрнологии, криобиолоИзобретение относится rc биологии и может быть использовано в экспериментальной эмбриологии, криобиологии, эмбриоинженерии, клеточной и генной инженерии.
Цель изобретения — повышение жизнеспособности пересаженных эмбрионов и упрощение способа.
Пример. Для осуществления способа используют эмбрионы на стадии конца бластулы - начала гаструлы, источником которых являются све жеснесенные яйца кур итальянской куропатчатой породы. Для воспроизведения известного способа яйца инкубируют в течение 12-42 ч в лабораторном инкубаторе-термостате.
Способ осуществляют следующим образом.
„„SU„„1518371 А 1
2 гии, клеточной и генной инженерии.
Цель изобретения — повышение жизнеспособности пересаженных эмбрионов и упрощение способа. Для этого используют эмбрионы конца бластулыначала гаструлы и питательную среду следующего состава, мас.%:,сыворотка крови 6- 15; эмбриональный эксч ракт 5-20; солевой раствор остальное.
Использование предлагаемого способа по сравнению с известным обеспечивает следующие преимущества: существенное повышение жизнеспособности трансплантированных эмбрионов, упрощение способа и сокращение на 10-20 мин времени, необходимого для трансплан" ф тации 1 эмбриона, расширение области применения способа. 2 табл.
Для выделения эмбриона на желток, в помещенный в чашку Петри бластодиском вверх, накладывают кольцо из фильтровальной бумаги, внутренний
3и а диаметр которого для удобства в даль- Ю нейшем должен превышать на 2-3 мм СФР наружный диаметр используемой для 3 культивирования эмбрионов камеры, При этом стремятся к тому, чтобы бластодиск оказался в центре кольца.
Под желточную оболочку инъецируют физраствор в количестве до 5 мп (в качестве.физраствора используют любой из известных солевых растворов: Ь
Рингера, Говарда, Тироде, 0,9-1%-ный раствор хлористого натрия и др.).
Затеи ве обрезают по наружному краю кольца. Пинцетом sa край кольца препарат переносят в чашку Петри с физ15!837!
f0 трансплантата остается прежней.
Перед трансплантацией эмбрион помещают в солевой раствор, например в раствор Говарда, и осторожно засасывают его н пипетку, имеющух) расширен ный конец диаметром 4-5 мм (для кури1!аг.тв<)рам и споласкивающими движения—
tIH в растворе смь(вают эмбрион с желточной оболочки. Смытый таким пугем эмбрион используют для криоконсервации или других экспериментальных целей, Оставшаяся после отделения эмбриона желточная оболочка может быть использована в качестве подлажк11 для посадки на нее эмбриона, При этом не имеет значения свой эмбрион на нее будет трансплантиронан или чужой. .г)ля приема трансплантата ее подготавливают. Вначале даполнитально очищают в растворе от остатков желточной . !ассы с помощью скребка, а затем споласкивают в нескольких <.мен!х физраствора и помещают для приел!а трансплантага на камеру, для культивирования внутренней стороной н )ерх,Камеру для культивирования перед этим заполIIsI!)T питательной средой, Приготовление питательной среды проводят заранее следующим образом. В чистую стерильную посуду отмеривают 10 мл (6-15 мл) сыворотки крови кур, полуенной общепринятым способом, добавляют к ней !0 мл (5-20 мл) куриного эмбрионального экстракта. Затем об-й объем питательной среды доводят до 100 мл соленым раствором, н качестве которого лучше всего использовать раствор Говарда. Приготовленную таким образа! питательную среду
< терилпзу!<)т путем фильтрования чер«э
)сбавка к питате)!ь1 эй < реде антиб«aTHкав н общепринят<)й концентра,(ии: ! 0000 ед, npHH При прон< пении некоторых исследований или рабат, например, в области криабиологии »тделенные oт собственной желточной оболочки эмбрионы хранят в замороженном састс)япии в течение требуемого времени (до негк..льких лет). Их трансплантацию проводят на желтачную оболочку, выделенную иэ другого яйца ° Используют для э их целей более дешевые пищевые (неаплэдотвореннь1е) яйца. Техника выделения оболочки и подготовки ее к приему ных амбр!!авив). Позволяют ему осесть в пипетке H,l нижний м«HHcK и перенаcH T в капле раствора на желтачную оболочку, Важна, чтобы эмбрион лег на желтачную оболочку дарсальной стороной (эктадермой). Если же ан лег нентральпой стороной или завернулся, тапкои текляннай пипеткой (палочкой) приводят эмбрион н нужное положение, Затем г помощью тонкой пипетки тщательно отсасывают остатки раствора вокруг эмбриона. Чашку Петри с камерами для культивирования, на которые посажены эмбрионы, накрывают крышкаIIII и помещают в термастат для культинира на> вся . Перныи к ач грал ь эс! ростом эмбрионов проводя через 12 — 1 3 ч, Б табл. 1 прин еденс аб,. с.наг ание ot!20 011ти(Iс!л 1 III>1)c и 1 P I!II !IItt< "IP с -,ц<- лов кан центра(л(и каждого кампопен га предлагаемойй 1(и гательнай среды. . гк «e!Iдетельств JIoT приведенныс данн!!с "T c j> <3ды cI>IB op oTKH !<)) ОI<11 (0>>>,1 II p, « га точна большом ка.IHчс..с т!.е к,>рина го 3мбриональна1 а э к< тракта \ I 5% H болеc) 70-80% эмбриона: яа <нн,a" < <)à3 т!1е, Однако в дальне II et г, прс) цес.с е культи) нрава! ия ани в б. ль.(!1!н - гне ; лучаев гиб 1ут на 2-4 гт;..! с опвг;ития. С )noc Tанляя 3 " и да!пгь!. C. !с.в учеHHtl: и на дру1;и O fCy TCT ВИЯ B CPS If по Tpeo!«3« Tt= в к<) .o.) )й v 3 ..: -) - !о-„ 40 появляется лишь со 2-4, тадий =знигия. Оп 1 пмальное с oc> TI!»zct 20); pf!c Tâoð Гс варда остал ьнос, При указанном соотношении кампанен "ав 80) 00% эмбрионов, трансплантированных на жел точную оболочку, начинают разя;тие, а при оптимальном саотнап е 0 ;1!1!1 -- !00% Причем эмбрионы имеют Зыс ак 3<с! жизнеспособность да. 11<гают 5;. последующих стадий развития <да 12-13 стадии), В табл, 2 предс. авлены данные 55 сравнительного испытания эффектигности известного и пред;!агаF- t!oão спосо-бов культивированиII ранних куринь(х эмбрионов. Они си!1;,-:тсльствуют а су18371 6-15 25 Сыворотка крови Эмбриональный экстракт Солевой раствор 5-20 Остальное Таблица 1 Количество эмбрионов, 7, начинающих развитие в зависимости от соотношения компонентов питательной среды Количество эмбрионов, 7 Количество сы воротки Количество куриного эмбрионального экстракта, мас.7 крови, мас.7 О 3 4 5 7 10 15 ?О 22 30 10 30 50 70 70 80 20 30 40. 60 70 70 40 40 40 60 60 60 30 50 50 70 60 60 50 80 80 80 70 50 60 80 90 90 70 40 50 80 90 90 80 30 60 80 80 80 60 30 60 50 70 60 50 30 60 30 40 50 50 30 60 70 60 70 50 60 70 70 90 90 100 90 100 90 90 90 70 60 50 30 О 10 О 10 l0 10 20 20 20 30 ЗО 40 30 40 40 40 30 30 30 30 О 4 6 )О l5 l8 20 щес твенном пр еимуществ е предлагаемого способа по результативности даже при использовании в известном способе эмбрионов, достигших до трансплантации третьей стадии развития. При этом в известном способе около 707. эмбрионов прикрепляются и начинают развитие, а в предлагаемом IOOX. Еще очевиднее преимущество данного способа при трансплантации по известному способу эмбрионов на первой стадии развития (стадия конца бластулы — начала гаструлы). В известном способе лишь 51Е из них начинают развитие, а в предлагаемом — 100%. Данное преимущество предпагаемого способа над известным достигается благодаря использованию более ранних эмбрионов, в частности на стадии конца бластулы — начала гаструлы. обладающих в данном возрасте наивысшей полипотентнсстью и устойчивостью к повреждающим внешним факторам, à также из-за использования предлагаемой питательной среды. О значении данной питательной среды свидетельствуют данные табл. 2, где в известном способе при 6 использовании эмбрионов на первой стадии развития и питательной среды из жидкой фракции белка яиц результативность оказалась даже ниже, чем в группе, где использовали эмбрионы на третьей стадии развития, формула изобретения Способ культивирования эмбрионов птиц, включающий отделение эмбриона от собственной желточной оболочки и трансплантацию его на другую желточную оболочку с последующей инкубацией в питательной среде, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения жизнеспособности пересаженных эмбрионов и упрощения способа, отделение эмбриона производят на стадии конца бластулы — начала гаструлы, а питательную среду используют следующего состава, мас.7: 1518371 Таблица 2 Сравнительное испытание эффективности культивирования эмбрионов птиц известным и предлагаемым способами начавших развитие шт. X 69,7 44 51,1 50 ю Количество эмбрионов Количество трансплантиСпособ культивирования Стадия развития достигших 5 стадии развития транспланрованных эмбрионов, шт. шт. ата 66 46 135 69 66,7 37,0 Известный Известный Предлагаемый с 1 390 390 100 390 lO0 Составитель И. Тареева Редактор М. Петрова Техред М.Ходанич Корректор В. Гирняк Заказ 6568/31 Тираж 501 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская. наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101
