Штамм гибридных клеток животных mus musculis, используемый для получения моноклональных антител к гемагглютинину вируса кори

 

Изобретение относится к области гибридомной технологии и может быть использовано для создания диагностических препаратов. Цель изобретения - получение мышиной лимфоцитарной гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела (монАТ) к гемагглютинину вируса кори, которые обладают высокой авидностью и проявляют иммунологическую активность в нескольких реакциях. МонАТ могут быть использованы в качестве иммунодиагностикумов. Штамм депопирован под номером ВСКК(П) N148Д. ПРОДУЦИРУЕТ МОНАТ КЛАССА JGG2A, СПЕЦИФИЧНЫЕ К ГЕМАГГЛЮТИНИНУ ВИРУСА КОРИ. МОНАТ ВЫЯВЛЯЮТ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ, АКТИВНОСТЬ В ИФА 1:72000. Продукция антител сохраняется в течение 50 пассажей. На основе монАТ к гемагглютинину вируса кори создан пероксидазный конъюгат, который может быть использован для выявления JGM и JGG антител человека к вирусу кори. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4327453/30-13 (22) 19.10.87, (46) 30.10.89. Бюл. У 40 (71) Московский научно-исследовательский институт вирусных препаратов (72) О.Г. Анджапаридзе, Ф.Г, Нагиева, Н.Н. Мальцева, С.Л. Ведунова, А.10. Звонарев, Н,И. Краснова, В.Г. Никулина, Е.П. Баркова, Г.В. Эткинд, Е.И. Кузнецова и Е.Г. Ходоровская (53) 578.085.23(088.8) (56) Hirrer М.I. Virology, v. 108, 1981, У 2, р. 381-390. (54) ИТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ

Мив ItlUsculiв, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ MOHOKJIOHAJIbHhIX АНТИТЕЛ К ГЕМАГГЛ10ТИНИНУ ВИРУСА КОРИ (57) Изобретение относится к гибридбмной технологии и может быть использовано для создания диагносты\

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для создания диагностических препаратов.

Цель изобретения — получение ьвппиной лимфоцитарной гибридолы, продуцирующей моноклональные антитела (монАТ) к гемагглютинину вируса кори, которые обладают высокой авидностью и проявляют иммунологическую активность в нескольких реакциях.

Штамм получают следующим образом.

Самок мышей линии BALB/с массой

8-10 г иммупизируют внутрибрюшинно двукратно с интервалом в две недели

„„SU» 1 369 А1 (sg 4 С 12 N 5/00, А 61 К 39/42

2 ческнх препаратов. Цель изобретения— получение мышиной лимфоцитарной гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела (монАТ) к гемагглютинику вируса кори, которые обладают высокой авидностью и проявляют иммунологическую активность в нескольких реакциях.

МонАТ могУт быть использованы. в качечестве иммуиодиагностикумов. Штамм депонирован под номером ВСКК (II)

Ф 148Д. Продуцирует монАТ класса

IgG2a, специфичные к гемагглютинину вируса кори. МонАТ выявляют в иммуноферментном анализе, активность в ИФА

1:72000. Продукция антител сохраняется в течение 50 пассажей. На основе монАТ к гемагглютинину вируса кори создан пероксидазньй конъюгат, который может быть использован для выявления IgM u IgG антител человека к вирусу кори. 2 табл. цельным частично очищенным препаратом вируса кори, пропассированным в первичной культуре клеток эмбрионов японских перепелов, выращенных на микроносителях ДЕАŠ— сефадекс

А-50.

Первую иммунизацию проводят вирусным антигеном в полном адъюванте

Фрейнда в дозе 5,0 lj ТЦД« на жаиь, вторая иммунизация — в той же дозе в неполном адъюванте Фрейнда. 3а три дня до слияния интраорбитально вводят

0,1 мп вирусосодержащего материала в солевом растворе в дозе 4,0 lj ТЦД« на мышь.! .) 8369

В качестве злокачественного партнера используют ьппиную лимфоцитарную линию NSO в фазе логарифмического роста. Миеломные клетки выращивают в среде RPMI-1640 с О,!37 ИаНС09, глюкозой до 4 г/л, 57. сыворотки эмбрионов коров и 57 сыноротки суягных овец (очищены полиэтиленгликолем), пируватом натрия 0,05 мг/л, оксало- !р ацетатом 0,15 мг/л, инсулином

0,2 ед/мл, 2-меркаптоэтанолом 5 10 И, НЕРЕЯ 5-10 мИ, гентамицином

50 мкг/мл. Имунные спленоциты получают на третий день после бустерной 15 инъекции антигена из стерильно извлеченных селезенок. Спленоциты извлекают путем мнот ократного введения в пульпу селезенки 0,1-0,2 мл холодной ростовой среды КРИТ-!640 с помощью 20 тонкой иглы со шприцем. 1. знлечение спленоциты собирают в пластиконые охлажденные пробирки, осаждают центриЬугированием при 1000 об/мин в течение !О мин, осадок клеток с зрит- 25 роцитами обрабатывают в течение

5 мин на холоду 0,83/-ным раствором

NH С1 в пятикратном объеме. После лизиса зритроцитов клетки повторно

:.аждают и дважды промывают н бессы- 30 вороточной среде RPMI-1640. Для слияния используют 507-ный раствор полиэтиленгликоля с м.в. !000. Иммунные спленоциты сливают с клетками 11ЯО в соотношении 4;1 и распределяют на двадцать 96-луночных пластин со споем=кормилкой из неиммунных r.пленоцитов. Селекцию гибридных клеток провоцят в среде НАТ, составленной из ростовой среды с 10 "- И гипоксантина (Н)„ 40

l,6 -10 И тимидина (Т) и 4 1 l аминоптерина (А), Начиная с трех суток с момента культинирования и в последующие дни, в лунки культуральных пластин каждые

3-4 дня вносят по 2 капли свежей селективной cpe r или из пластин удаляют 0,1 мл культуральной среды и заменяют на свежую. Начиная с ?О сут с момента культивирования, клетки из ;р лунок, в которых наблюдается рост гибридных клеток, пересевают н 24-луночные пластины со слоем-кормилкой иэ неиммунных спленоцитов. Неиммунные спленоциты ресуспендируют в гибридомной среде НТ (селективная среда беэ аминоптерина) и по 0,1 мп распределяют в 24-луночные пластины (спленоциты, полученные от одной мыши, ра< пределяют на две 24-луночные пластины). Кпоньl гибридных клеток, растущие в 24-луночных пластинах сo слоем-кормилкой, выращинают до формирования сплошного слоя, а затем клетки пересенают н ?4-луночные пласти«ы без слоя-кормилки. После формирования сплошного слоя клеток проводяг первичный скрининг культуральных жидкостей на наличие вирусоспецифических антител в тнердофазном иммуноферментном анализе (ИФА). В качестве твердой фазы используют клетки Чего, инфицированные вирусом кори, штамм Л-16, Антителопродуцирующие клони гибридных миелом нь н::щивают в пластиксьвих флакона: площадью

25 clt со слоем-кормилкой из сплс.иоцитов и после накоп. ения клеток н дос та точном коли че . тв е (с плошнос l10 крытие ростоной поверх«о; ти флакона) проводят оценку монАТ н культуральных жидкостях на актиннос сь и спец,:— фичность, По данным проведенного ис;.целования осуществляют выбор кло«ов для их накопления в массовой кульгуре и криоконсервации.

В результате с гияния полу на коллекция гибридов„ лро;*,уцируюгл ". аь 41 к вирусу кори (штамм JI-!6 ), Из них практический питере прелставляюгибридома ВК-93.2, прод пир юшал

",.онАТ класса IpG 2а, напра ленные к гемагглютинину вируса кори- Характерисьик» актив«ости и lму«оглобул.<«ов„ продуцируемых гибридс.лой ВК9 3,?. представлена в табл,I, Приведенные двиньte лоэьс. .; г заключить, что мо«Ат, продуцируемие гибридомой ВК-93.2, обладают ад«на;,;вои высокой реактивностью с двумя исследованными штa iмами вируса кори (штамм Л-16 и ш гамм I.ЕС-вирус кони) в различных тестах и не выявляют вирус чумы плотоядных (штамм Х121, .

Штамм гибридомы депо«иронан под номером ВСК!< (If) М - 148Д и имеет следующие признаки, Купьтуральные признаки.

Стандартные условия выращивания, .,реда для культивирования — RE ÌÒ â€ 16 с 0,13 ИаНСО, глюкозой до 4 г/.и, 5% сыворотки эмбрионов коров и 57 сиворотки суягных овец (очищен«а с помощью полиэтиленгликоля), пирунатом натрия 0„05 мг/мл, оксалоацетатом

0,15 мг/мл, инсули«ом О,? ед/..л, 2-ме каптоэтаноло." 5 10 1, НЕРЕЯ

15!8369

5-10 м11. Температура культивирования с

36,5 С. Клетки растут в суспензии, обладают слабой адгезивной способ2S ностью к поверхности пластика или стекла. Посевная доза 200-300 ° 10 клеток/мл, кратность рассева 1:4-1:6 два раза в неделю, Культивирование гибридомы в организме животного. !О

Самок мышей линии BALB/с в возрасте 2-2,5 мес сенсибилизируют

0,5 мл пристана внутрибрюшинно эа

7-10 дней до введения 2-4 !0 гибридных клеток, через 10-14 дней формиру — 15 ется асцитная опухоль. Перевиваемость гибридомы в 1001 случаев.

Характеристика полезного продукта, Гибридная линия ВК-93.2 продуцирует моноклональные антитела, выяв- 20 ляемые в иммуноферментном анализе (1ФА), в р==з:кции непрямой иммунофлуоресценции (НИФ), в реакции торможения гемаглютинации (РТГА), в реакции нейтрализации на культуре клеток (РН).

Активность антител в иммунных асцитных жидкостях: в ИФА — 1:720000; в НИФ вЂ” 1:32000 в РТГА — 1:5120;

РН -1:64 МонАТ относятся к классу 30 иммуноглобулинов G2a. Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 50 пассажей в культуре клеток (время наблюдения) и 6 пассаж и на мышах линии BALB/с (время наблюдения).

Способ криоконсервации.

Среда дпя замораживания включает сыворотку эмбрионов коров 90, диметилсульфоксид 10, 1 мл клеточной 40 суспенэии с плотчостью не ниже 2 10 жизнеспособных клеток, ресуспендированных в холодном криоконсерванте, переносят в пластиковые 1,8-миллитровые ампулы, укладывают в пенопластиковую коробку с толщиной стенок не меньше 1,5 см и немедленно помещают на холод — (-701-(-80) С. На следующие сутки ампулы переносят в жидкий азот. Замороженные ампулы оттаивают я! в воде с температурой 37-39 С. Клетки разводят в 10 раз сывороткой эмбрионов корон или суягных онец и осаждают центрифугированием при

500 об/мин в течение 10 мин, Восстановленные клетки ресуспендируют в ростовой среде в концентрации 2,5 "

10- -3,0 10 жизнеспособных клеток в 1 мл, переносят в плscòèêовые культуральные флаконы. Жизнеспособность после размораживания составляет 6070Я и устанавливается по дифференциальной окраске клеток с помощью

0,25K-ного раствора трипанового синего, приготовленного на фиэиопогическом фосфатно-буферном растворе, рН 7,2-7,3.

Пример 1, На сонове монАТ, продуцируемых гибридомой ВК-93,2, создан диагностический препарат пероксидазный конъюгат для иммуноферментного анализа. Основной для его получения является иммунная асцитная жидкость (ИАЖ) с титром в ИФА

0,73 10, Иммуноглобулины из ИАЖ высолены с помощью 507-ного сульфата аммония. Фракция IgG очищена методом аффинной хроматографии на белке

А — сефарозе 4В.

В табл. 2 представлены результаты экспериментов по идентификации вируса кори в прямом иммунофарментном анализе с помощью конъюгата на основе монАТ, продуцируемых гибридомой

ВК-93.2.

Как видно из табл..", конъюгат, приготовленный на основе ИАЖ, содержащей монАТ к гемагглютинину, вируса кори (штамм Л-16), специфически выявляет вирус кори (штамм Л-16 1 и вирус кори (штамм LEC) и не выявляет вирус чумы плотоядных.

Использование гибридомы позволяет получать монАТ, специфичные к гемагглютинину вируса кори, Формула и з о б р е т е н и я

1Чтамм гибрдиных клеток животных

Mus musculis BCKK(II) Р" 148Д, используемый для получения моноклональных антител к гемагглютинину вируса кори.

1518369

Таблица

Характеристика моноклональных иммуноглобулинов, продуцируемых гибридомой ВК-93.2, по специфичности и антительной активности в различных тестах

Активность антител в иммунных асцитных жидкостях в различных тестах (приведены обратные величины)

И МФА

Способность реагировать со штаммами вируса кори

РТГА РН ин витро

ФА

5 ..10

Неисследовано

720 10

720 10

32 !0

32 10З

Л-16

LEG

Неисследовано

6,4 10

Контроль: Вирус чумы плотоядных (штамм ЭПМ) (контроль) О

П р и м е ч а н и е..ИФА — иммуноферментный анализ;

МФА — метод флуоресцируюших антител;

РТГА — реакция торможения геммагглютинации; РН вЂ” реакция нейтрализации.

Таблица 2

Определение активности и специфичности пероксидазного конъюгата, приготовленного на основе монАТ, продуцируемых гибридомой ВК-93.2, с различными антигенами

Антигены Оптическая плотность при 492 нм при разведениях

1:200 1:400 1:800 I!1600 1:3200 1:7400 1:14800

l,165 0,923 0,598

1 ° 322 1ь227 0в,887

0,281 0,260 0,250

0,091 0,08 0,06 0,03 0,02

0,02

0,02

Составитель А. Маныкин

Редактор М. Петрова Техред М.Ходанич Корректор М. Максимишинец

Заказ 6568/31 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открьггиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская,наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Вирус кори (штамм Л-16) 1,513

Вирус кори (штамм LFC) 1,554

Вирус чумы плотоядных 0,363

Неинфицированные клетки Чего

Оэ398 Ов261 Ов239

0,630 0,379 0,27

0,103 0,096 0,071