Способ количественного определения биогенных моноаминов

 

Изобретение относится к физико-химическим методам анализа, в частности к потенциометрическому определению микроколичеств моноаминов в биологических средах и может быть использовано для клинического и токсикологического анализа в медицине и фармакологии. Целью изобретения является расширение функциональных возможностей способа, упрощение и удешевление. Определение общего количества биогенных моноаминов осуществляют при помощи ферментсодержащего препарата в виде желатиновой пленки с моноаминооксидазной активностью, причем суммарное количество тирамина и серотонина определяют при помощи ферментсодержащего препарата, обработанного профлавином с концентрацией (5-8)<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-4</SP>М, а количество серотонина - при помощи ферментсодержащего препарата, обработанного профлавином с концентрацией (1,0-1,5)<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-3</SP>М.

СОЮЗ CQBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АBTOPCKOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4333632/31-13 (22) 20.10.87 (46) 30.!0.89. Бюл. В 40 (71) Научно-производственное объединение "Биолар" и Латвийский государственный университет им. П.Стучки (72) Д.Ю.Балцере, Б.А.Гринберг, А.А.Прикулис, Е.Б.Никольская и О.В.Ягодина (53) 663.18(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 1282006, кл. G 01 N 33/48, 1984. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОГЕНН1!Х ИОНОАМИНОВ (57) Изобретение относится к физикохимическим методам анализа, в частности к потенциометрическому определению микроколичеств моноаминов в

Изобретение относится к фиэикохимическим методам анализа, в частности к потенциометрическому определению микроколичества моноаминов в биологических средах, и может быть использовано для клинического и токсикологического анализа в медицине и фармакологии.

Цель изобретения — расширение функциональных воэможностей способа, упрошение и удешевление. . Определение общего количества биогенных моноаминов осуществляют при помощи ферментсодержащего препарата в виде желатиновой пленки с моноаминооксидазной (МАО) активностью, причем суммарное количество тирамина и

„„SU„„1518375 А (М 4 С 12 Ц 1/26, "..; 1! 33! 48, С 12 N ll/02 биологических средах, и может быть использовано для клиническогQ и токснкологического анализа в медицине и фармакологии. Цель изобретения расширение функциональных воэможностей способа, упрощение и удешевление.

Определение общего количества биогенных моноамйнов осуществляют при помощи ферментсодержащего препарата в в.лде желатиновой пленки с моноаминооксидаэной активностью, причем суммарное количество тирамина и серотонина определяют при помощи ферментсодержащего препарата, обработанного профлавином к концентрацией (5

8) 10 М, а количество серотонинапри помощч ферментсодержащего препарата, обработанного профлавином с концентрацией (1,0-1 5) 1О М.

-3 серотонина определяют при помощи ферментсодержащего препарата, обработанного профлавином с концентрацией и (5-8) !0 моль/л, а количество серотонина — при помощи ферментсодержащего преп;.рата, обработанного профлавином с концентрацией (1-1,5) 10 моль/л, Изобретение обеспечивает расширение функциональных возможностей способа эа счет воэможности определения тирамина.и серотонина как в сумме, так и избирательно.

Способ осуществляют следующим образом.

Ферментсодержащий препарат — желатиновую пленку с МАО активностью помещают в сосуд для измерения элек1518375 трода с газовым зазором, добавляют исследуемый раствор. В закрытом сосу.де в термостате при перемешивании проводят инкубацию. После инкубации ферментсодержащую пленку вынимают, добавляют КС1, охлаждают, закрывают пробкой с рН-электродом, вводят раствор NaQH (pH > 12) для освобождения аммиака. После установления постоянного потенциометра находят по градуировочной прямой значение концентрации моноаминов, соответствующее значению потенциала.

Для определения общего количества моноаминов используют уерментсодержащий препарат с MAO активностью без обработки ингибитором.

Для определения суммы тирамина и серотонина используют фе >ментсодержащий препарат с МАО активностью, обработанный профлавином с концентрацией (5-8) 10 моль/л.

Для определения количества серотонина используют ферментсодержащий 25 препарат с MAO активностью, обработанный профлавином с концентрацией (1-1,5) "!О моль/л.

П р и и е р I. Ферментсодержащий

-репарат для определения моноаминов в биологических жидкостях получают следующим образом. 0,01 г МАО (моноаминооксидазы) или 2 r гомогената митохондрий печени с МАО активностью растворяют в 0,05-0,07 M фосфатном буфере с рН 7,3-7,5 и смешивают с

2-7Ж -ным раствором желатина. Получен-ную смесь выливают на нерастворимую подложку и высушивают в потоке воздуха. Поверхность полученной пленки обрабатывают 2-83-ным раствором глутарового альдегида (ГА) в течение

3-5 мин, Избыток ГА сливают и промывают водой и фосфатным буферным раствором с PH 7,3-7,5. Далее желатино-,вую пленку, содержащую МАО, обрабатывают фосфатиым буферным раствором профлавина с концентрацией ингибитора (5-8)-10 моль/л или (1

1,5) 10 моль/л в течение 40-50 мин.

Потом избыток раствора сливают, промывают пленку фосфатным буфером н высушивают в потоке воздуха при комнатной температуре. Пленки, полученные иэ 0,5 г желатина, обрабатывают 30 кп раствора профлавина.

Активность моноаминооксидаэы, включенной в желатиновые пленки, по разным субстратам: по тирамину — не менее 4,55

1О мкмоль/мг белка; по серотонину — не менее 3,7 .

«10 мкмоль/мг белка, по бензиламину — не менее З,Х

«10 < мкмоль/мг белка или 1600 Ei г пре парата (условные спектрофотометрические единицы) °

За условную единицу активности

МАО принимают такое количество фермента, которое обуславливает увеличение оптической плотности при

250 нм в 10-миллиметровой кювете при 25 (. на 0,001 ед. за 1 мин.

За единицу активности МАО принято такое количество фермента„ которое э» 1 мин ферментативно расщепляет мкмоль субстрата.

Желатиновые пленки, обработанные профлавином, пригодны для многократного использования, поскольку профлавин является необратимым ингибитором MAO и в условиях испальэования пленок не вымывается в течение всего срока пригодности, который лимигируется механической сохранностью пленки. Срок годности пленки 4 мес (при проведении пяти определений кедневно). В сухом ниде при 4l0 С ферментативная активность пленки сохраняется в течение 9 мес.

Определение общего клличества моноаминоя.

Пример 2. Ферментсодержащий препарат -- жепатиновую ленку с МАО активностью размером lхl см - помещаог в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют i«5 мл

0,15 моль/л раствора КС1 и 0,5 кп исследуемой крови человека. Измерительный сосуд закрывают, помещают н термостат при 40 С, включают магии ную мешалку и 10 мин пропускают

О без СО q. Далее поток перекрывают í герметически закрытый сосуд выдерживают 50 мин при 40 С с интенсивным перемешиванием. После инкубации ферментсодержащую пленку вынимают, в со: уд добавляют 1,4 г КС1, охлаждают

-осуд до 25 (,, закрывают пробкой со ;.lE.êëÿHíûì- рН электродом, на поверхьо< n.. которого помещена капля 0,2Хного раствора тритона Х-305 в бидистиллированной воде, снова пропускают

Оа без СО„, а затем через капилляр вводят в реакционную смесь 0,2 мл

1 моль,!л NaOH (рН 12) для полного освобождения аммиака. После установ.

1518375 6 рамина и сеоотонина (0,2 мкг/мл крови), соответствующее значению пс,— тенциала.

Пример 5. Определение ведут аналогично примеру 4, однако применяют ферментсодержащий препарат желатиновую пленк 1 с "1AO активностью, обработанную профлавином с концентрацией 8 10 4 моль/л.

Находят суммарную концентрацию тирамина и серотонина (0,27 мкг/мл).

Пример 6. Определение ведут аналогично примеру 4, однако приме15 няют ж латинову енку с МАО активностью, обработанную профлавином с

-4 концентрацией 6,5 10 моль/л.

Суммарная концентрация тирамина и серотонина 0,27 мкг/мл.

Пример 7. И сосуд для измерений электрода с газовым зазором помещают ферментсодержащий препарат желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную ингибитором профлавином с концентрацией 4,0 -10 моль/л. Добавляют 3 5 мл 0,15 ил/л раствора

КС1 и 0,5 мл исследуемой крови человека. Далее проводят ннкубирование и определение аналогично примеру 2.

По градуировочной прямой находят значение концентрации моноаминов (0,30 мкг/MJI)> соответствующее значению потенциала. В данном случае результат завьппен из-эа недостаточно35 го ингибирования активных центров

МАО> ответственных за дезаминирование бензиламина и, слецовательно, определяется еще и часть бензиламина.

55 пения постоянного потенциала (рН) (" 20 мин) на электроде записывают показания потенциометра (рН-метра).

По градуировочной прямой находят значение концентрации общих моноами нов, соответствующее значению потен циала, Для контроля содержания аммония в крови проводят аналогичный холостой опыт с желатиновой пленкой без фермента.

Общее содержание моноаминов рассчитывают как разницу между общим количеством аммиака и фоновым количеством аммиака в холостой пробе.

Общее количество моноаминов в крови 0,36 мкг/мл крови. Во.всех опытах использована кровь одного донора.

Пример 3. Ферментсодержащий препарат — желатиновую пленку с MAO активностью размером lxl см, использованную в примере 2, — прополаскивают водой и помещают в сосуд для измерения электрода с газовым зазором,добавляют О, 24 мл 5 10 моль/л раствора бенэнламина, 0,24 мл

5 10 моль/л раствора тирамина, 0,32 мл 5.10 моль/л серотонина и

0,2 мл 5 -10 моль/л фенилэтиламина.

Туда же добавляют 3 мл К-фосфатного буфера рН 7,6. Общий объем реакцион ной смеси 4,0 мл. Концентрация в реакционной смеси, моль/л: бензиламин 3 10 ; тирамин 3 10 ; серото-7 -т нин 4 -10 ; фенилэтиламина 2,5 10

Общая концентрация моноаминов в реакционной смеси 12,5 10 моль/л.

Проведение инкубации и определение аналогично примеру 2.

По градуировочной прямой находят общее количество моноаминов (12,6 10 моль/л).

Определение суммарного количества тирамина и серотонина.

Пример 4. ферментсодержащий препарат — желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 5 -10 моль/л, помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют

3 5 мл Q,15 моль/л раствора КС1 и

0,5 мл исследуемой крови чу овека.

Далее проводят все операции аналогично примеру 2.

Находят по градуировочной прямой значение суммарной концентрации тиПример 8. В сосуд для измерений электрода с газовым зазором помещают ферментсодержащий препарат желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную ингибитором профлавином с концентрацией 9,5 10 моль/л. Добавляют 3,5 мл 0,15 моль/л раствора

КС1 и 0,5 мл исследуемой крови человека. Далее проводят инкубирование и определение аналогично примеру 2.

По градуировочной прямой находят значение суммарной концентрации моноаминов (0,24 мкг/мл). В данном случае результат занижен, поскольку завьипенная концентрация ингибитора частично ингибировала уже активные центры МАО, ответственные за дезаминирование тирамина и, следовательно, определяется все количество серотонина и только часть тиранила.

7 15183

Пример 9. Ферментсодержащий препарат — пленку с MAO активностью, обработанную профлавином с концентрацией 6 10 моль/л, — помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют 0,32 мп

5 1 Ю моль/л раствора серотонина, 0,24 мл 5 10 моль/л раствора тирамина и 0,24 мл 5 .10 моль/л раствора бензиламина. Туда же добавляют 3,2 мп

К-фосфатного, буфера, рН 7,6. Общая концентрация моноамннов в реакцион-6 ной смеси 1 10 моль/л (с :ротонина

4 10 моль/л, тирамина 3 10 моль/л, бенэиламина 3 -10 моль/л) .

-т !5

Определение аналогично примеру 2.

По градуировочной прямой находят значение концентрации суммы тирами-7 на и серотонина (7 -10 моль/л), соответствующее значению потенциала.

Определение серотонина.

Пример 10. Ферментсодержащий препарат — желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную профлави- 25 ном с концентрацией 1,3-10 моль/л,— помещают в сосуд для измерения электрода с газовым зазором, добавляют

3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС1 и

0,5 мл исследуемой крови человека.

Далее проводят все операции аналогично примеру 2. Находят по градуировочной прямой значение концентрации серотонина (0,15 мкг/мп).

Пример 11. Определение ведут аналогично примеру 10 с испольэовани35 ем желатиновой пленки, обработанной профлавином с концентрацией 1,5 10 моль/л .Находят концентрацию серотонина (0,15 мкг/мп).

Пример 12. Определение ведут аналогично примеру 10 с использованием желатиновой пленки, обработанной профлавином с концентрацией

-1

1,4"10 моль/л. Найденная концентра- 4 ция серотонина 0,15 мкг/мп.

Пример 13. Ферментсодержащий препарат — пленка с МА0 активностью, обработанная профлавином с концентра-, цией 9,0 -10 моль/л. Добавляют 3,5 мп

0,15 моль/л раствора КС1 и 0,5 мп

50 исследуемой крови. Далее осуществляют инкубирование и определение аналогично примеру 2.

По градуировочной кривой находят значение концентрации моноамина (0,17 мкг/мп). В данном случае результат концентрации серотонина эавьппен, поскольку концентрация

75 ингибитора профлавина недостаточна для полного ингибирования активных центров МАО, деэаминирующих тирамин, и, следовательно, вместе с серотонином определяется еще и часть тирамина.

Пример 14. Ферментсодержащий препарат — пленка с MAO активностью, обработанная профлавином с концентрацией 1,6 10 моль/л ° Добавляют

3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС1 и

0,5 мл исследуемой крови. Далее осуществляют инкубирование и определение аналогично примеру 2 °

По градуировочной кривой находят значение концентрации моноамнна (0,15 мкг/мл). Аналогично примерам

10-12 определяют все количества серотонина. Следовательно, оптимальным препаратом для определения серотонина является пленка, обработанная профлавином с концентрацией (1—

-3

1,5).10 моль/л. Применение препарата, обработанного увеличенным количеством ингибитора, не требуется и является нецелесообразным.

Пример 15. Ферментсодержащий препарат — пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 1,4 10 моль/л, — помещают в сосуд, добавляют 0,24 мл 5 °

«10 моль/л раствора бенэиламина, 0,24 мп 5 .10 моль/л тирамина, 0,32 мп 5.10 моль/л c=.ротоннна. Добазляют 3,2 мл К-фосфатного буфера с PH 7,6 для доведения общего абьема реакционной смеси до 5 О.

Концентрация серотанина в реакционной смеси 4 10 моль/л. Определение аналогично примеру 2.

Значение концентрации моноамина, найденное по градуировочной прямой,—

-т

4 10 моль/л, что соответствует введенному количеству серотонина, Пример 16. Ферментсодержащий препарат — желатиновую пленку с MAO активностью, обработанную профлавином с концентрацией 1 10 моль/л,помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют

3,5 мп 0,15 моль/л раствора КС1 и

0,5 мл исследуемой крови человека, Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 40 С, включают магнитную мешалку и 10 мнн пропускают 02. без СО q. Далее поток перекрывают и герметически закрытий сосуд о выдерживают 50 мин при 40 С с интен1О

1518

Значение концентрации серотонина, найденное по градуировочной прямой, 4 10 моль/л, что соответствует введенному количеству °

Чувствительность способа 2 10 з моль/л.

Интервал линейности калибровочно1

ro графика способа 2 .10 2 10 моль/л.

ФормулаиэобретенияПо градуировочной прямой находят значение концентрации серотонина 20 (О, 15 мкг/мл), соответствующее значению потенциала.

Пример 17. Ферментсодержащий препарат — пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентра- 25 цией 1 10 моль/л, — помещают в сосуд для измерений электрода с газовым за,зором, добавляют 0,24 мп 5.10 моль/л бенэиламина, 0,24 мл 5 .10 моль/л тирамина, 0,32 мп 4 -10 моль/л серото- 30 нина, 0,2 мл 5 10 моль/л фенилэтиламина. Добавляют 3,0 мп К-фосфатного буфера с PH 7,6. Концентрация серотонина в реакционной смеси 4

11) моль/л. Определение аналогично примеру 16.

Составитель А.Семенов

Техред М.Ходанич Корректор Э.Лончакова

Редактор М.Петрова

Заказ 6568/31 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГК11Т СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4!5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина,101 сивным перемешиванием. После инкубации ферментсодержащую пленку вынимают, в сосуд добавляют 1,4 г КС1, ох лаждают сосуд до 25 С, закрывают пробкой со стеклянным рН-электродом, на поверхность, которого помещена капля 0,2Х-ного раствора тритона Х-305 в бидистиллированной воде. Снова пропускают Oz без СО и затем через 10 капилляр вводят в реакционную смесь

0,2 мп 1 моль/л NaOH (рН 12) для полного освобождения аммиака. После установления постоянного потенциала (рН) (20 мин) на электроде эапи- 15 сывают показания потенциаометра (рН-метра, °

Способ количественного определения биогенных моноаминов путем их дезаминиревания при помощи ферментного препарата с моноаминооксидазной активностью с последующим потенциометрическим определением образовавшегося аммиака при помощи рН-электрода, отличающийся тем, что, с целью расширения функциональных воэможностей способа, упрощения и уде- шевления, определяют общее количества биогенных аминов при помощи ферментсодержащего препарата, выполненного в виде желатиновой: пленки с моноаминооксидазной активностью, причем суммарное количество тирамина и серотонина определяют при помощи ферментсодержащего препарата, обработанного профлавином с концентрацией (5-8).10 моль, а количество серотонина — при помощи ферментсодержащего препарата, обработанного профлавином с концентрацией (1,0—

1,5) 10 моль.