Способ определения аутоиммунных комплексов липопротеид- антитело

 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и может найти применение при диагностике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Целью изобретения является повышение точности определения аутоиммунных комплексов липопротеид - антитела. Способ заключается в том, что указанный комплекс выделяют с помощью ультрацентрифугирования в среде с физиологической ионной силой с плотностью 1,022 - 1,080 г/мл, затем разделяют на антиген и антитело с помощью повторного ультрацентрифугирования в среде с PH 2,5 - 3,0 или 10,0 - 11,0 и с плотностью не меньше, чем при первом ультрацентрифугировании и не больше @ 1,080 г/мл и после перевода раствора антител и антигена в среду с нейтральным PH определяют наличие специфических к липопротеидам антител, причем плотность среды при обоих ультрацентрифугированиях доводят до нужных величин с помощью растворов, приготовленных на тяжелой воде. Положительный эффект изобретения заключается в повышении точности определения аутоиммунных комплексов липопротеид-антитело при диагностике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний.

СО(ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) А1 (50 4 С 01 N

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

llO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHGMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4334976/28-14 (22) 08,1 2,87 (46) 07.12.89. Бюл. М 45 (71) Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины

АМН СССР (72) А.Д.Денисенко (53) 615.373 (088.8) (56) Климов А.Н., Денисенко А.Д. и др. Обнаружение аутоиммунного комплекса липопротеид-антитело в плазме крови и стенке аорты человека.

Вопр. мед. хим, 1978, У 4, с. 539. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОИММУННЬИ

КОМПЛЕКСОВ ЛИПОПРОТЕИД вЂ” АНТИТЕЛО (57) Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и может найти применение при диагностике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Целью изобретения является повышение точности определения аутоиммунных комплексов липопротеид — антитело. Способ заключается

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии и может найти применение при диагностике иммунологических нарушений при атеросклерозе и его клинических проявлениях: ишемической болезни сердца, окклшзии периферических сосудов и, т.д.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Способ выполняют следующвк образом .

К сыворотке (плазме) крови добавляют физиологический раствор 0,9Х2 в том, что указанный комплекс выде— ляют с помощью ультрацентрифугирования в среде с физиологической ионной сипой с плотностью 1, 022-1, 080 г/мл, затем разделяют на антиген и антитело с помощью повторного ультрацентрифугирования в среде с рН 2,5-3,0 или

10,0-11,0 и с плотностью не меньше, чем при первом ультрацентрифугировании и не больше; 1,080 г/мл и после перевода раствора антител н антигена в среду с нейтральным рН определяют наличие специфических к липопротеидам антител, причем плотность среды при обоих ультрацентрифугированиях доводят до нужных величин с поМощью ра- а створов, приготовленных на тяжелой е воде. Положительный эффект изобретения заключается в повышении точности определения аутокммунных комплексов С липопротеид — антитело при диагностике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний. ный раствор NaC1 приготовленный на

Д 0 до достижения плотности растй вора 1,022-1,080 г/мл, и полученную смесь ультрацентрифугируют при

100000g в течение 18-22 ч. Супернатант отсасывают и добавляют к нему буфер с рН 2,5-3,0 или 10,0-11,0 и с плотностью 1, 110 г/мл, также приготовленный на Д О1и подвергают повторному ультрацентрифугированию при

150000g в течение 5-8 ч. После ультрацентрифугирования нижнюю фракцию переводят в нейтральный рН и используют для определения антител, напри1527592 мер, с помощью реакции связывания комплемента, реакции пассивной гемагглютинации, иммунодиффуэии, иммуноферментного метода и т.д.

Пример 1. К 5 мл сыворотки крови больного А. с ишемической болезнью сердца добавляют 1 мл 0,9Хного раствора NaC1 приготовленного на Д О, чтобы довести плотность сыворотки до 1, 022 г/мл . Затем сыворотку ультрацентрифугируют в роторе

50.3 на ультрацентрифуге Спинко L-8 (Бекман, США) в течение 18 ч при

10 С и скорости 40000 об/мин

15 (100000g) ° Супе рнатант, содержащий смесь свободных ЛП и аутоиммунного комплекса (АИК) ЛП-АТ, отсасывают в объеме 1,5 мл и добавляют 4 мл 0,05 М глицинового буфера, приготовленного на Д О, РН 10 0 и плотностью

1,110 г/мл.Результирующаяплотность при этом 1,080 г/мл.Образец снова ультрацентрифугируют в роторе SW 65 Ti на той же ультрацентрифуге при скорости

45000 об/мин (150000g) в течение 5 ч.

После этого из пробирки отсасывают нижние 1,5 мл, содержащие раствор антител, и с помощью 1 M раствора соляной кислоты доводят РН до 7,5. В 30 полученной фракции содержалось

150 мкг иммуноглобулина, который специфически связывался с липопротеидами, как это было установлено в реакции связывания комплемента (в разведении 1:32), в реакции пассивной гемагглютинации (в разведении 1:64}, и с помощью иммуноферментного метода (в разведении 1:500) °

Это свидетельствует о наличии в 40 плазме крови этого больного АИК ЛПАТ и явилось показанием к назначению ему иммунокоррегирующей терапии (Т-активин) .

Пример 2, К 5 мл сыворотки крови больного Б. с ишемической болезнью сердца было добавлено 8 мл

0s 9Х-ного раствора NaC1 на Д О, чтобы получить плотность 1, 08 г/мл, Затем сывоРотку ультрацентрифугируют в роторе 50 Ti при скорости .40000 об/мин (1 00000g) в течение

22 ч и отбирают верхнюю фракцию (1,5 мл) . К этой фракции дооавляют

4 мл буфера Михаэлиса с РН 2,5 и плотностью 1,110 г/мл для получения плотности среды 1,080 г/мл и образец ультрацентрифугируют в роторе SW 65 Т при скорости 40000 об/мин в течение

8 ч. Затем отбирают нижнюю фракцию, содержащую антитела, и верхнюю фракцию, содержащую липопротеиды (обе фракции в объеме 1,5 мл), и с помощью 1 М раствора гидроокиси натрия доводят РН до 7,5. В полученной фрйкции антител содержалось 120 мкг иммуноглолубинов, которые специфически реагировали с липопротеидами в реакции связывания комплемента (в разведении 1:8), пассивной гемагглютинации (в разведений 1:32) .

Таким образом, в сыворотке крови данного пациента присутствует АИК

ЛП-AT, что послужило поводом для проведения этому больному курса гемо» сорбции на активированном угле.

Способ позволяет повысить точность определения аутоиммунных комплексов липопротеид — антитело по сравнению с методом с использованием ВаЯО+ в среднем на 357.

Формул а из обрет ения

Способ определения аутоиммунных комплексов липопротеид — антитело путем ультрацентрифугирования сыворотки крови в среде с физиологической ионной силой с последующим отделением супернатанта и разделением иммунных комплексов на антиген и ан- титело и выявлением специфических антител к липопротеидам с помощью тестсистемы, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, перед ультрацентрифугированием к сыворотке крови добавляют физиологический раствор с плотностью

1,022-1,080 r/ìë, приготовленный на тяжелой воде, а разделение компонентов иммунного комплекса проводят путем добавления к супернатанту буферного раствора с РН 10,0-11,0 или

2,5-3,0 и плотностью не менее, чем плотность супернатанта, и не более

1,080 г/мл, приготовленного на тяжелой воде, далее полученную смесь дополнительно ультрацентрифугируют в течение 5-8 ч, отделяют нижнюю фракцию, содержащую антитела, и нейтрализуют в ней РН.