Способ получения люциферазы светляков luciola мingrеliса

 

Изобретение относится к биохимии, а именно к способу получения гомогенного препарата люциферазы светляков LUcIoLa мINGRеLIса, и может быть использовано в медицинском микроанализе, генной инженерии. Цель изобретения - обеспечение гомогенности и повышение удельной активности люциферазы и концентрации белка. Способ включает получение экстракта светлячков, гель-фильтрацию экстракта или высаливания сульфатом аммония, анионообменную хроматографию, аффинную хроматографию на полисахаридном носителе, модифицированном 1-амино-4((4-хлор-6 ((3-сульфофенил)амино)-1,3,5-триазин-2-ил)амино)-3-сульфофенил)амино)-9,10-дигидро-9,10-диоксо-2-антраценсульфоновой кислотой (голубой триазиновый краситель). Получают гомогенный препарат люциферазы с удельной активностью 2<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">9</SP> мВ/мг. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЩЕЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЛ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4332804/31-13 (22) 24. 11. 87 (46) 28.02.90. Бюл. М 8 (71) МГУ им. M.Â.Ëoìñíoñoâà (72) Е.И.Дементьева, Г,Д.Кутузова, В.А.Букатина и Н.Н.Угарова (53) 577.15.07(088.8) (56) Филлипова Н,А,, лухович д.ф., Букатина В.А,, Угарова Н.Н. Аллостерический механизм регуляции активности люциферазы светляков Luciola mingrelica,— Биохимия, 1984, т. 49, вып. 12, с. 1965-1971. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛОЦИФЕРАЗЫ

СВЕТЛЯКОВ LUClOLÀ МТЮЗЕ?.ХСА (57) Изобретение относится к биохимии, а именно к способу получения гомогенного препарата люцифераэы свет ляков Luciola mingrelica, и может

Изобретение относится к биохимии, а именно к способу получения гомогенного препарата люциферазы светляков

Luciola mirigrelica.

Цель изобретения - обеспечение гомогенности и повышение удельной активности люциферазы и концентрации белка.

Отличительной особенностью предла/ гаемого способа является проведение после ионообменной хроматографии аффинной хроматографии на полисахаридном носителе, модифицированном голубым- триазиновым красителем, при соотношении белок:носитель 1:30-500, проведение элюирования люцифераэы буферным раствором, содержащим 1-15 ммоль

АТФ или 1-5 ммоль люциферина.

„.Я0„„1546484 А 1

2 быть использовано в медицинском микроанализе, генной инженерии. Цель изобретения - обеспечение гомогенности и повышение удельной активности люциферазы и концентрации белка. Способ включает получение экстракта светляков, гель-фильтрацию экстракта или высаливание сульфатом аммония, анионообменную хроматографию, аффинную хроматографию на полисахаридном носителе, модифицированном 1-амино-4((4-хлор-6((3-сульфофенил)амино)-1,3,5-триазин-2-ил)амино)-3-сульфофенил)амино) -9,10-дигидро-9, 10-диоксо-2-антраценсульфоновой кислотой (голубой триаэиновый краситель) . По- а лучают гомогенный препарат люцифераэы с удельной активностью 2 ° 10 мВ/мг.

1 з.п. Ф-лы, 1 табл.!

Пример !. 2,5 г сухих лампочек светляков растирают в порошок в охлажденной ступке в смеси с 2,5 г карборунда и экстрагируют 25 мл

0,05 M трис-ацетатного буфера, рН

7,8, содержащего 2 мМ ЭДТА, 0,3 М

NaCl, в течение 4 ч при 4 С. Центрифугируют 30 мин (20000 об/мин, 4 С), осадок отбрасывают, Полученныи экстракт наносят на колонку с сефадексом С-25 (грубым), уравновешенным

0,05 М трис-ацетатным буфером, рН

7,8, содержащим 2 мМ ЭДТА, 10 мМ

MgSO,. Элюируют люциферазу тем же бу фером. Фракции, содержащие активную люциферазу, наносят на колонку с

ДЭАЭ-сефарозой, уравновешенной тем же буфером. Затем колонку промывают

1546484

Голубая агароза

5 10

2 -109

1:600

1: 500

АТФ

ATA

5 .10-з

0,01

Гомогенный препарат

1:100

1:30

2.109

" ° 109 АТФ

АТФ

0,03

0,04

«ll»

Гомогенный препарат

1:20

1 30

1:30

1 109

5 ° 10

2 ° 10

АТФ

АТФ

АТФ

0 5

0,1

5.10-з

0,01

l l»

«! I »

Гомогенный препарат

2-1O

2 10

1:30

1:а 30

АТФ

АТФ

0 05

0,05 тем же буфером для удаления с носителя, несвяэавшихся веществ. Люцифераэу элюируют тем же буфером, но содержащим 60 мМ Mg$0,. Ro фракциях, содер- жащих люциферазу, спектрофотометрическим методом определяют концентрацию белка, и полученные фракции наносят на колонку с голубой агарозой в соот-! ношении белок:носитель 1:30. Несвязав-10 шиеся белки смывают 0,05 М трис-ацетатным буфером, рН 7,8,. содержащим

2 мМ ЭДТА, 60 мМ ИР$0 . Злюцию люциферазы проводят тем же буфером, содержащим 15 мК АТФ. Получают раствор лю- 15 цифераэы с концентрацией белка

0,05 мг/мл и удельной активностью

2 10 мВ/мг. Выход по активности сос9 тавляет 1004 от исходной.

Раствор люциферазы после аффинной хроматографии на голубой агарозе концентрируют в 10 раз ультрафильтрацией на фильтре Amicon с использованием мембраны УМ-30. При концентрировании сохраняется 100 активности. Получают 25 раствор люцифераэы с концентрацией белка 0,5 мг/мл. При диск-электрофореэе в йолиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия препарат дает одну полосу, что свидетельствует о его гомогенности.

Остальные примеры проводят аналогично примеру 1 с изменением носителя, соотношения белок:носитель и концентрации АТФ или люциферина, Результаты хроматографии люцифера- З5 зы на голубой агарозе и голубой сефврове при различных соотношениях белок:носитель и различных концентрациях привеаены в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ получения люциферазы обеспечивает получение препарата гомогенной люциферазы в концентрированном виде с удельной активностью 2 ° 10 мР/мг. Высокая активность и гомогенность препарата делает возможным его использование в биохимии, медицинском микроанализе для определения ультрамалых колиI честв АТФ, в генной инженерии, Формула изобретения

1. Способ получения люциферазы светляков Luciola mingrelica, включающий получение экстракта светляков, очистку его от низкомолекулярных примесей гель-фильтрацией или высаливанием сульфатом аммония и фракционирование с помощью анионообменной хроматографии, отличающийся тем, что, с целью обеспечения гомогенности и повышения удельной активности люциферазы, после анионообменной хроматографии проводят аффинную хроматографию на полисахаридном носителе, модифицированном 1.-амино-.

-4 ((4-хлор-6((3-сульфофенил) амино)-1, 3, 5-триази н-2-ил) вми но) -3-сул ьфофенил) амино) -9, 1О-ди гидро-9, 10-диоксо-2-антраценсульфоновой кислотой при соотношении белок:носитель 1:30-500 и элюцию ведут буферным раствором, содержащим 1-15 ммоль аденозин-5 -трифосфата или 1-5 ммоль люциферина.

2. Способ по и.1, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения концентрации белка, полученный препарат подвергают ул ьтра филь тра ции .

Продолжение таблицы

164Ыйй

2 ° 1О-з

0,01

2 105

2 "10

1:30

1:30

Люциферин О, 5

Люциферин 1

Люциферин 2,5

1:30

0,03

Голубая агароза

0,.01

1: 500 Люциферин 2, 5

Голубая сефароза

2 10

«I I »

1 30 АТФ 15

Составитель О,Скородумова

Техред А.Кравчук Корректор 0.Фпле

Редактор H.Êèøòóëèíåö

Заказ 56 Тираж 480 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,101

1:100 Люциферин 2, 5

1:30 Люциферин 5

1;30 Люциферин 7,5

0,03

0,05

0,05 с

0,05

2-10

2 -.10

2,10

2 10з

2.iO

«I1»

Гомогенный препарат

«I I»

Гомогенный препарат

«11»

«I I »

«11»