Вектор pfh 124 для получения фрагментов днк с произвольными "липкими" концами и способ его конструирования

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и генетической инхе Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных ДНК методами генетической инженерии и может найти применение в биотехнологии при создании штаммов-продуцентов целевых продуктов. Целью изобретения является повышение стабильности рекомбинантов. Цель достигается конструированием векторной плазмиды pFH S24, состоящей из следующих элементов: нерии. Целью изобретения является повышенир стабильности. Сконструирована векторная ДНК pFH 124, имеющая молекулярную массу 1,8 Md, содержащая Pvu II - большой фрагмент ДНК плаэмиды pUC 18 с репликоном этой плазмиды и геном |3 -лактомазы, а также Pvu II - малый фрагмент ДНК плазмиды рМВ 124, (включающий часть модифицированного |гена й-галактозидады с синтетическим полилинкером. Полилинкерная область длиной 42 п..о. ограничена Е. coRI и Pst I сайтами, а между попарными сайтами Fok I и Hga I противоположной полярности содержится набор сайтов эндонуклеаз рестрикции Sal GI, Асе I, Hind II, Bam HI. 2 с.п. ф-лы. Pvu II - фрагмента ДНК плазмиды pUC 18 (2364 п.о.), содержащего репликон плазмиды pUC 18 и ген р-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину; Pvu II - фрагмента ДНК плазмиды рМВ 124 (320 п.о.), включающего в свой состав часть модифицированного гена р-галактозидазы и синтетический полилинкер, имеющий структуру i fe с; о к а

СОЮЗ СОВЯТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

{51)5 С 12 N 15/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (54) ВЕКТОР рЕН 124 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

ФРАГМЕНТОВ ДНК С ПРОИЗВОЛЬНЫМИ "ЛИПКИМИ" КОНЦАМИ И СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ (57) Изобретение относится к молеку.-лярной биологии и генетической инжеPvu II — фрагмента ДНК плазмиды

pUC 18 (2364 п.о.), содержащего репликон плазмиды pUC 18 и ген Ъ -лактамазы, определяющий устойчивость к ам" пициллину;

Ф

© ф

©

4 Я целевых продуктов. Pvu II — фрагмента ДНК плазмиды

Целью изобретения является повыше- рМВ 124 {320 п.о.), включающего в ние стабильности рекомбинантов . сьой.состав часть модифицированного

Цель достигается конструированием гена Р-"галактоэидазы и синтетический векторной плазмиды рРН 124, состоящей полнлинкер, имеющий структуру

GGATGCGCGTCGACAAGCTAGC TTGGAÒ СССССТСАТСС АС

ACGTCCTACGCGCAGCTGTTCGATCGAACCTAGGCGCAGTAGGTCTTÀÀ, содержащий между попарными сайтами эндонуклеаз рестрикции Fok Т и Hga I противоположной полярности сайты для эндонуклеаз рестрикции Sal GI, Асс I, л л

Hinc II u Ham HI. Вставка субфрагмента для клонирования осуществляется по Sal GI u 8am HI-сайтам полипинкерной области. Емкость вектора не менее

200 п.о.

I (46) 15.01. 91. Бюл. N 2 (21) 4387533/30-13 (22) 03.03.88 (71) Всесоюзный научно-исследователь" ский институт молекулярной биологии (72) А. Н. Синяков, Н. К. Данилюк, и О. И. Серпинский (53) 5?5.224.2; 577.2/048(088.8)

{56) Авторское свидетельство СССР .по заявке М 4149175/28-!3, кл. С 12 Ы 15/00, 30.09.87.

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных ДНК методами генетической инженерии, и может найти применение в биотехноло-. гии при создании штаммов-продуцентов из следующих элементов:

„„SU„:, 1552643 А1

2 нерии. Целью изобретения является повышение стабильности. Сконструирована векторная ДНК pFH 124, имеющая молекулярную массу 1,8 Hd, содержащая

Pvu II — большой фрагмент ДНК плаэмиды pUC 18 с репликоном этой плазмипы и генома -лактомазы, а также Pvu IIмалый фрагмент ДНК плазмиды рМВ 124, включающий часть модифицированного гена -галактозидады с синтетическим полилинкером. Полилинкерная сбласть длиной 42 п о. ограничена Е. caRI u

Рзс Т сайтами, а между попарными сайтами Fok I u Hga Х противопойожной полярности содержится набор сайтов ,эндонуклеаэ рестрикции Sal GI, Асс Т, Hind II, Ваш HI. 2 с.п. ф-лы, !!!таммьгхозяева: штаммы Е. со1 с !

)ac Z !М 15-фенотипом. Молекулярная масса плаэмпды pFH 124 равна 1,8 Nd (2684 п.о.) .

Для достижения цели иСпользуют пособ конструирования вектора

РЕН 124, заключающийся в том, что ДНК

pIJC 18 гидролизуют эндонуклеазой рест» рикции Ртля II, вь!целяют фрагмент дли- lð ой 2364 п .о., циклиэуют его с помою Т4 Д!1К-лигаэы, полученной лигазНой смесью, трансформируют Клетки

coli ТМ 103, отбирают клоны, устойчивые к ампициллину с Lac-феноти" пом е ДИК 1 полученную иэ этих клонов д расщепляют эндонуклеазой рестрикции

Pvu II и лигируют c, Pvu-фрагментом

ДНК рИ3 124 (320 п, о. ), попученной лигаэной смесью, трансформируют клетки 20

F,. coli IN 103, отбирают клоны, устойчивые к ампициллину с Lac фенотипом.

Прим е р 1. 50мкгДНКплаэмиды рМВ 1? 4 гидролизуют эндонуклеа- 25 згй рестрикции Pvu II в 100 мкл раствора, содержащего буфер 1 (50 мМ трис HCl, рН 7,5, 10 мМ М8С1,, !О мМ 2-меркаптоэтанол} и 50 мМ NaC1 1 ч при

37 С. Реакционную смесь прогревают 30

2 мин при 65 С, добавляют 10 мкл 0,17. бромфенолового синего в 50%-ном водном глицерине и подвергают электрофореэу в 47. IIAAI". Фрагмент ДНК длиной

320 н.о. элюируют иэ геля на ионооб- 35 менную бумагу ДЕ-8!. С бумаги фрагмент смывают 1,5 М ЫС104 (рН 8,2х25 мкл) о при 50 С и осаждают 10 объемами ацетона. Осадок промь,вают этанолом, высушивают на воздухе и растворяют. в

30 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-НС

1 мМ ЭДТА, рН 8,0). мкг ДНК рцС 18 гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Рчп II в услови" ях, описаннь!х выше. 1О мкл реакционной смеси после отжига (5 мин, 65 C) инкубируют .с 5 ед. ДНК-лигазы фага

Т4 в 20 мкл буфера 1, содержащего

0,25 мМ АТФ в течение 12 ч при !О С.

Десятую часть реакционной смеси используют для трансформации клеток

E. coli IN 103, обработанных СаС1

Плаэмида рБС 18 сообщает клеткам

Е. coli IN 103 фенотип Lac . Транс" форманты отбирают на 1,5% YT-агаре, содержащем 50 мкг/мл ампициллина, Y-gal, !О М IPTG. Колснии, имеющие .

Lac-фенотип, содержащие pIJG 18 .без природного Pvu ТТ фрагмента, культивируют в 5 мп среды 12 ч при 37 С, 1 мкг плаэмидной ДНК, выделенной из этой биомассы, . расщепляют эндонуклеазой рестрикции Pvu II в объеме 30мкл.

Реакционную смесь разбавляют 10 объемами 2Х-ной LiC104 в ацетоне, осадок промывают этанолом, сушат на воздухе.

Затем растворяют его в 30 мкл буфера

1, дополнительно содержащего 0,5 MM

АТФ и инкубируют с 1 мкг Pvu II-фрагмента ДНК (320 п.о ° ) pNB 124 в присутствии 5 ед. ДНК-лигазы фага Т4 12 ч о при 10 С. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е, coli IN 103, как описано выше. Из колоний, ииеющих .1.ас -фенотип, щелочным методом выделяют ДНК, которую анализируют путем

Pvu II, Bsp I, Bam HI. Sal GI-гидро1 ! лиза.

Пример 2. Определение стабильности рекомбинантов вектора рРН 124 с максимальной и минимальной длиной встроенного фрагмента. а) для определения рекомбинантов вектора pFH 124 с макси!альной длиной встроенного фрагмента в этом векторе клонируют по Pst I u Sal I-сайтам фрагмент ДНК полноразмерной копии гена интерлейкина — 2 человека, длиной

413 п.о.

Дпя этого 0,25 пкмоль векторной

ДНК, полученной иэ pFH 124, совместным расщеплением эндонуклеазами рестрикции Pst I (7 ед. 50 мМ NaC1, 1 ч, 37 С) и Sal Gl (10 ед. 150,мМ NaC1

1 ч, 37 С) и 3 пкмоль указанного фрагмента ДНК обрабатывают 20 ед. Т ДНКлигазы в условиях, описанных выше.

Подученной лигаэной смесью трансформируют клетки Е. coli IN 103, Колонию

+ с Lac фенотипом .проводят через 4. пассажа, как описано в примере 2. После каждого пассажа выделенную иэ биомассы рекомбинантную плаэмидную

ДНК рП. 2 анализируют Pvu II Bsp Т, Есо RI -I — Pst I эндонуклеаэами рестрикции. Результаты гидролиэа соот-, ветствуют ожидаемым и равны 200, 520, 7260 п.о для Pvu II — рестриктаэы;

11,.80, 202, !74, 267, 287, 290, 380, 434, 457Ä 587 n.v. для Bsp I — рестриктазы и 440 п.о, для Есо RI

Pst Т пары рестриктаэ, Фенотип трансформированных клеток не зависит от числа проведенных пассажей. Количест-,. во колоний с укаэанными фенотипом . составляет 970+25 на 1000.шт при 957. уровня доверия;

5 1552643

О б) для определения рекомбинантов зируют Bam HI, Sal GI, Вэр I рестривектора pFH 124 с минимальной длиной ктаэами., а также определяют нуклеовстроенного фрагмента в этом векторе тидную последовательность полилинкера клонируют два олигонуклеотида методом Максама-Гильберта. Клетки

CGCGTCATCCAG (12 п.о.) и

F.. coli, трансформированные плазмидой

AATTCTTGGATCACGCG (16 п.о,), которые pFH 125, имеют Lac фепотип, который образуют между собой комплементарный не изменяется с числом проведенных дуплекс длиной 12 п.о, пассажей. На 1000 клонов с укаэанным

Для этого 5 пкмоль ДНК pFH 124 10 фенотипом приходится 990+10 при 95Х гидролиэуют 20 ед.. рестриктаэы Sal GI уровня доверия. в 50 мкл буфера 1 и 150 мИ NaCl в условиях, описанных выше. Реакционную Таким образом, предложенный вектор смесь осаждают ZX-ным LiC104 в ацето- рГН 124 пригоден для получения фрагне. Промытый и высушенный осадок ра- 15 ментов с произвольнып "липкими" констворяют в этом же объеме буфера 1. цами. Плазмиды pFH 123 и pFH 124 (ee

К раствору добавляют dNTP до концен- производная) имеют высокую стабильтрации 100 мкИ, 6 ед. ДИК-полимеразы ность. После 4 пассажей не менее 95Х

1 (фрагмент Кленова) и реакционную клонов сохраняют исходный фенотип.. смесь выдерживают 10 мин при комнат- 20 ной температуре. Затем смесь nporpe- Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я вают 2 мин при 65 С, добавляют 5 м

NaCl, 20 ед. Есо RI рестриктазы и 1. Вектор pFH 124 для получения выдерживают раствор еще ч при 37 С фрагментов ДНК с произвольными "липДНК из раствора осаждают 2Х-ным 25 кими" концами с мол.мас. 1,8 Md, .раэLiC10y в ацетоне. Осадок растворяют мером 2684 п.о. и содержащий: в 100 мкл буфера 1. К раствору добав- Рчи II — фрагмент ДНК плаэмиды ляют по 100 пкмоль указанных вьппе pUC !8 размером 2364 п.о. с репликоолигонуклеотидов, 20.ед. Т„ ДНК"лига- ном плаэмиды pUC 18 и геном Р-лактаэы и оставляют на 12 ч при 5 С. 30 мазы, определяющим устойчивость к ам1 0 мкл лигазной смеси используют для пициллину! трансформации клеток Е.со11 IM 103. Pvu II — фрагмент ДНК плаз:щды

Колонию с Ьас -фенотипом проводят

+ рИВ 124 размером 320 п.о., включающий через 4 пассажа. После каждого пас- часть модифицированного гена Р-галак сажа выделенную из биомассы рекомби- тозидаэы и синтетический полилинкер

35 нантную плазмидную ДНК рГН 125 аиали- размером 42 п.о,, имеющий структуру (.

GGATGCGCGTCGACAAGCTAGCTTGGATCCGCGTCATCCAG

АССТССТАСССССАССТСТТССАТССААССТАСССССАСТАССТСХТАА а также между попарными сайтами эндо-, нуклеаэ рестрикции Fok I u Hga I противоположной полярности-сайты для эндонуклеаз рестрикции Sal GI, Асс I, Hind II u Ham HI; фрагменты размером 26, 34, 67; I 10, 147. 200, 242, 404, 432,. 489,, 500 п.о. . образующиеся после расщепления зндоиуклеазой рестрикции Msp I; фрагменты размером 11, 80, 100, 164, 260, 267, 290, 434, 457, 587 п.о., образующиеся после расщепления зндонуклеаэой рестрикции Bsp фрагменты размером 8, 88, !81, 244, 287, 616, 1244 п.о., образующи" еся после расщепления эндонуклеаэой рестрикции Го! I; вставку .субфрагмента для клонирования по Sal GI и .Bam HI-сайтам полилинкерной области; емкость вектора от 12 до 413 п.о,; штаммы-хозяева: штаммы Escherichia

coli c lac Z ЙИ 15-фенотипом; кратность клонируемого субфрагмента (Эп+2).

2. Способ конструирования вектораpFH 124, заключающийся в том, что

ДНК рУС 18 гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Pvu II, фрагмент ДНК размером 2364 п.о. цкклиэуют с помощью

Т4-ДНК-лигазы, полученной лигаэной смесью трансформируют клетки F. coli

IM 103, отбирают клоны, устойчивые к ампициллину с Lac Z -фенотипом, далее ДНК, полученную иэ этих клонов, расщепляют эндонуклеазой рестрикции

Pvu II и лигируют с Pvu II — фрагментом ДНК- рМВ 124, полученной лигазной

1552643

Составитель Т. Забойкина

ТехредИ.Дндык Корректор Л. Бескид

Редактор Л. Лалкова Заказ 676 Тираж 373 Подписное

ВНИИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж"35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно"издательский комбинат "Патент", r.ужгород, уп „Гагарина, 101 смесью трансформируют клетки Е. cori. М 103, отбирают клоны, устойчивйе к ампициллииу с Еас - фенотипом и выделяют вектор рГН 124.