Способ получения большого фрагмента днк-полимеразы i еsснеriснiа coli - фрагмента кленова

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способам получения ферментов для обеспечения генно-инженерных работ. Целью изобретения является повышение выхода, удельной активности и качества очистки фермента. Отличительная черта предложенного способа получения фрагмента Кленова, обеспечивающая достижение цели, - новая совокупность методических приемов на стадии хроматографической очистки ферментного препарата. Хроматографию проводят в 2 этапа: сначала на клонке с ион-гидрофобным сорбентом - солозой КГ 8/24 и элюцией активного белка линейным градиентом KSL от 0 до 1 М в буферном растворе

затем - на колонке с красителем красно-коричневым 2К, иммобилизованным на CL-сефарозе 6В через декстран и тем же, что и в первом случае, способом элюции. Выход препарата составляет 65%, удельная активность (при определении с ДНК тимуса теленка) 15000 ед/мг, чистота - 96,2%. Фрагмент Кленова, полученный новым способом, может быть использован для всех видов генно-инженерных работ. Применение изо

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

f10 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4373546/30-13 (22) 08,02,88 (46) 07.02.90. Бюл. 5 (71) Научно-производственное объединение пФермент и Всесоюзный научноисследовательский институт особо чистых биопрепаратов (72) 3.А. Баронайте, P.С, Вайткявичене, Р,П, Марцишаускас, О,Ф. Суджювене, И.-Г.И. Песлякас, Н,М. Федо= рова и В.A. Пасечник (53) 577.072(088.8) (56) Joyce С.M., Grindley N.D.F.

Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 1983, 80, 1830-1834. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БОЛЬШОГО ФРАГ МЕНТА ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ I EBCHERICHIA

- СОЫ-ФРАГМЕНТА КЛЕНОВА (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способам получения фер-. ментов для обеспечения генно-инже.нерных работ, Целью изобретения является повышение выхода, удельной активности и качества очистки фермента.

Отличительная черта предложенного

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, в част.— ности к способам получения ферментов для обеспечения генно-инженерных работ.

Цель изобретения — повышение выхода, удельной активности и качества очистки фермента.

Основу предложенного способа и его главную отличительную черту, обес„„SU„„)541256 А1 (51) 5 С 12 N 15 00 9/00

2 способа получения фрагмента Кленова, обеспечивающая достижение цели, новая совокупность методических приемов на стадии хроматографической очистки ферментного препарата. Хроматографию проводят в 2 этапа: сначала на колонке с ион-гидрофобным сорбентом — солозой КГ 8/24 и элюцией активного белка линейным градиентом КС1 от 0 до I М в буферном растворе; затем на колонке с красителем красно †коричнев 2К, иммобилиэованным на СЬ-сефароэе 6В через декстран и тем же, что к в первом случае, способом элюции. Выход препарата составляет 65Х, удельная активность (при определении с ДНК тимуса теленка)

Я

15000 ед./мг, чистота 96,2%. Фрагмент Кленова, полученный новым способом, может быть использован для всех видов генно-инженерных работ.

Применение изобретения имеет большое 2 значение в решении задачи обеспечения биотехнологических исследований в нашей стране необходимым количеством фермента высокого качества. 2 э.п. ф-лы, 1 табл.

Ю печивающую достижение поставленной цели, составляет новая совокупность методических приемов на стадии хроматографической очистки ферментного препарата.

После фракцнонирования фермента сульфатом аммония проводят хроматографию на колонке с ион-гидрофобным сорбентом — соло эой КГ 8/24 с элюци- . ей активного белка линейным гради1541256 ентом КС1 от 0 до 1 М в буферном, растворе, После этой стадии выход фрагмента Кленова достигает 75-80Х, а очистка — 30 раз, На втором этапе

5 хромато графической очистки используют колонку с красно-коричневым 2К,. иммобилизованном íà CL-сефарозе 6В через декстран, и тот же принцип элюции, что и на первой стадии, После второго этапа хроматографической очистки выход фермента составляет

60-65%, а очистка — 150 раз, Чистота препарата по данным электрофореза в ПАА-геле составляет

96,2Е. Полученный препарат имеет удельную активность 15000 ед./мг (при определении с ДНК тимуса теленка) и 90000 ед./мг (при определении с ДНК лосося), что в 2-3 раза выше, чем при получении фермента из- вестным способом. Фрагмент Кленова, очищенный предложенным способом, отвечает современным требованиям к этому препарату и может быть исполь- 25 зован в секвенировании ДНК методом

Сэнгера и в сайт-специфическом мутагенезе при решении задач белковой инженерии.

Пример 1. Получение сорбента — солозы КГ 8/24.

Приготовление дисперсионной среды.

В реактор, снабженный мешалкой, обратным холодильником и термометром, вводят 325 мл,тридекана и стабилизаторы суспензии (9 мл) Span.-85 и (0,7 мл) Тюееп-85, перемешивают ири комнатной температуре в атмосфере аргона, Приготовление дисперсной фазы.

В отдельной емкости проводят растворение в смеси (30 мл) диметилформамида и (42 мл) воды следующих компонентов: метакриловая кислота 4,1 мл; метиленбисакриламид 2,7 мл; пероульфит аммония 1,03 г и бутилметакрилат

1,1 мл. Перемешивают при комнатной температуре. Полученный раствор представляет собой дисперспую фазу, Формирование эмульсии и полимери- 50 зация. В дисперсионную среду при перемешивании и барботаже аргоном вводят дисперсную фазу, включают обогрев реактора и проводят полимеризацию при

70 С в течение 5 ч. Далее гранулы сорбента отделяют фильтрованием, отмывают водой и детергентом, и далее— дистиллированной водой. Фракционируют мокрым рассевом на ситах, выделяя фракцию 80-120 мкМ.

Получение аффинного сорбента

CL-с ефарозы 6 — красно-коричневый

2К. К 180 мп CL-сефарозы 6В производства фирмы Фармация" (Швеция) прибавляют 40 мл воды, нагревают до

60 С и при перемешивании механической мешалкой прибавляют небольшими порциями 4 78 мг красно-к оричнево го 2К, растворенного в 20 мл воды. После перемешивания в течение 30 мин прибавляют 24 г ИаС1 и перемешивают при

60 С еще 1 ч. Смесь нагревают до

80 С, прибавляют 2,1 г Na СОЭ, пере0; мешивают 2 ч, фильтруют и отмывают холодной и горячей (80 С) водой до получения бесцветного фильтрата. Получается сорбент, содержащий !,7 мкМ красителя красно-коричневого 2К на

1 мл CL-сефарозы 6В. Приготовленный сорбент CL-сефароза 6 — красно-коричневый 2К имеет формулу

OH

N .- Я=Я

ХаО,В "< )-иН irNH

$03Хс

0-СЕУАРОЗА С! -6В

Для определения концентрации крас но-коричневого 2К на сефарозе в элюэнте измеряют оптическую плотность при 525 нм и согласно молярному коэффициенту экстинкции красителя (13500 м "..п .см ), находят количество непрореагировавшего красно-коричневого 2К. Из разницы между взятым количеством красно-коричневого

2К и найденным в элюэнте находят количество лиганда в микромолях на

1 мл сефарозы, Выделение и очистка фрагмента

Кленова, Получение ферментного экстракта. 50 г клеток Е.coli суспендируют в 200 мл 0,05 М трис-НСI рН

7,5 буфера, содержащего 0,002 М ЭДТА, 0,001 М дитиотрейтола, 0,02 мМ фенилметилсульфонилфторида и 1 мг/мл лизоцима ° Суспензию выдерживают

15 мин в ледяной бане и разрушают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН2Т. Обломки клеток осаждают центрифугированием при 48000 g в течение 1 ч.

Выпавший осадок отбрасывают, центрифугат (215 мл) используют для выделения фермента, Фракционирование ферментного экстракта полимином P и сульфатом аммония. К центрифугату (215 мл), полу5 15412 ченному на предыдущей стадии, при постоянном перемешивании в течение

30 мин добавляют 107.-ный (13,7 мл) раствор полимина P до конечной концентрации 0,67, После добавления 5 всего объема полимина перемешивание продолжают еще 30 мин. Экстракт центрифугируют в течение 15 мин при 4000

Полученный осадок используют для получения фрагмента Кленова. Фермент экстрагируют из осадка 100 мл 0,1 М калий-фосфатным буфером рН 7,0, содержащим 0,001 И /ь-меркаптоэтанол, 0,002 М ЭДТА, О,1 M NaC1. Процедуру повторяют еще раз. Супернатанты объединяют, Экстракт центрифугируют в течение 15 мин при 4000 g, К супернатанту (230 мп), медленно перемеши вая, добавляют сухой сульфат аммония 20 до 607. насыщения,, смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин.

Раствор центрифугируют в течение

15 мин при 21000 g. Осадок отбрасывают, а к супернатанту добавляют су- 25 хой сульфат аммония до 857.-ного насыщцнияя. Осадок собирают, растворяют в 20 мл О, 0l М калий-фосфатного буфера рН 7, О, содержащего 0,001 М р-меркаптоэтанола, помещают в диализ- 30 .ную трубку и диализуют в течение 18 ч против 2 л указанного буфера. Получают 34 мл диализата.

Хроматография фрагмента Кленова на колонке с солозой КГ 8/24. Диализат фермента (34 мл) подвергают хроматографии на колонке (1,5 23 см) с солозой КГ 8/24, уравновешенной диализным буфером. После нанесения ферментного раствора колонку промыва- 40 ют 150 мл исходного буфера. Элюирование фермента осуществляют линейным градиентом (450 мп) KCl от О до 1, О M в исходном буфере. Собирают фракции по 9 мл. Фрагмент Кленова элюируется в пределах 0,4-0,6 M КС1, Активные фракции объединяют ° Получают 50 мл ферментного раствора, который диали- зуют в течение 18 ч против 2 л

0,01 M трис-HCl буфера рН 7,5, содержащего 0,01 И ИяС1, 0,01 М р-меркаптоэтанола и 67. глицерина. Получают 50 мл диализата.

Хроматография фермента на колонке с CL-сефарозой 6 — красно-корич55 невый 2К. Диализат фрагмента Кленова (50 мл) подвергают хроматографии на колонке (1,5 14 см) с СЬ-сефарозой 6 — красно-коричневый 2К, 56 6 уран нов еше иной диализ ным буфе ром.

После нанесения ферментного раствор: колонку промывают 75 мл исходного буфера, Элюирование фермента осуществляют линейным градиентом (250 мл)

КС1 от О до 1,0 М в исходном буфере, Собирают фракции по 5 мл. Фрагмент Кленова элюируется в пределах

0,25-0,6 M КС1 ° Активные фракции объединяют и используют для концентрирования.

Концентрирование конечного препарата ° Объединенные фракции диализуют против 50 мл 0,05 M калии-фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 0,5 мИ дитиотрейтола и 507 глицерина (по объему). Диализ продолжают в течение

12 ч. Препарат помещают в предварительно охлажденную емкость и хранят при -20 С..Выход фрагмента Кленова о составляет 6000 ед./г биомассы с удельной активностью 15000 ед./мг белка, Активность фрагмента Кленова определяют по включению в активированную тимусную ДНК (обработанную панк" реатической дезоксирибонуклеазой).

За единицу активности принимается то количество фрагмента Кленова, которое при температуре 37 С за 30 мин включает 10 нмоль дезоксирибонуклеозидфосфатов в ДНК-матрицу, Пример 2. Способ получения фрагмента Кленова осуществляют аналогично примеру l, однако при хроматографии на колонке с солозой КГ

8/24 используют исходный буфер, содержащий 0,005 М калий-фосфат pl . 6,5 и 0,0005 M р-меркаптоэтанол, а при хроматографии на колонке с CL-сефарозой 6 — красно-коричневый 2К используют сорбент, содержащий 1,2 мкМ красителя/мл сефарозы, а исходный буфер содержит О, 005 М трис-НС1-буфер рН 7,0; 0,005 М MgC1 р-меркаптоэтанол и 57-ный глицерин. Выход фермента составляет 5000 ед./r биомассы с удельной активностью 13000 ед./мг белка, Пример 3. Способ получения фрагмента Кленова осуществляют ана- логично примеру 1, однако при хроматографии на колонке с солозой КГ

8/24 используют 0,05 M калий-фосфат рН 7,5 и 0,005 M P -меркаптоэтанол, а при хроматографии на колонке с

CL-сефарозой 6 — красно-коричневый

2К используют сорбент, содержащий

1541256

Способ поКонцентрация. ° фермента, ед./мкл

Выход фермента, %

Удельная активлучения фрагмента

Кленова ность, ед,/мг белка по примеру

65 15000 17, О

ЬО 13000 15,0

63 14000 16, О

Сост авит ель О. Скуратовская

Техред N.Ходанич Корректор О. Кравцова

Редактор А. Мотыль

Подписное

Тираж 501

Заказ 264

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина,101

2,4 мкИ красителя/мл сефарозы, а исходный буфер содержит О, 05 М трисНС1-буфер рН 7,8; 0,05 И МдС1д, 0,05 М р-меркаптоэтанол и 10 -ный глицерин. Выход фермента составляет

5470 ед./r биомассы с удельной активностью 14000 ед./мг белка.

Результаты получения фермента по предлагаемому способу представлены .в таблице, t

Таким образом, преимущество пред ложенного способа заключается в воз можности получения высокоочищенного препарата с более высокими выходом и удельной активностью, чем при использовани t известных способов, Применение изобретения имеет больmac значение в решении задачи обеспе чения генно-инженерных работ в нашей стране необходимым количеством фраг.мента Кленова высокого качества.

Формулаизобретения

1. Способ получения большого фрагмента ДНК-полимеразы Х Fscherichia coliфрагмента Кленова, включающий разрушение бактериальных клеток, осаждение нуклеиновых кислот и связанных с ними белков полимином Р, экстракцию осадка раствором хлористого натрия, фракционирование сульфатом аммония и хроматографическую очистку конечного продукта, о т л и ч а ro щ и и с я тем, что, с целью повышения выхода, удельной активности и качества очистки фермента, хроматографическую очистку проводят в две стадии: на колонке с солозой КГ 8/24 и элюцией

15 .пикейным градиентом КС1 от О до 1 И в буферном растворе, а затем на колонке с CL-сефарозой 6В, связанной с красителем красно-коричневым 2К, и элюцией линейным градиентом КС1 от

20 О до 1 И в буферном растворе.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а— ю щ ч и с я тем, что в качестве буфера при хроматографии на колонке с солозой КГ 8/24 используют 0,0050,05 М К-фосфатный буфер с рН 6,57,5, содержащий О, 0005-0,005 И g-меркаптоэтанол. !

3. Способ по п. 1, о тли ч аю30 шийся тем, что в качестве буфера при хроматографии на колонке с

CL-сефарозой — красно-коричневым 2К используют 0,005-0, 05 M трис-HClбуфер с рН 7,0-7,8, содержащий 0,00535 0,05 M MgClg, 0,005-0,05 M в-меркаптоэтанол и 5-10 .-ный глицерин.