Рекомбинантная плазмидная днк @ 33, кодирующая метилазу s @ 11, и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент метилазы s @ 11

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, обусловливающую синтез метилазы SSOLL, и штамм, содержащий эту рекомбинантную ДНК - продуцент метилазы SSOLL. Целью изобретения является получение штамма, продуцирующего только метилазу SSOLL без сопутствующей рестриктазы, а также увеличение уровня синтеза метилазы SSOLL в клетках бактерий. Получен штамм, продуцирующий только метилазу SSOLL без рестриктазы, и повышен уровень синтеза метилазы SSOLL в клетках бактерий в 40 раз по сравнению с используемым ранее. 2 с.п. ф-лы, 1 табл.

„„Я0„„1 532585 А1 (51)4 С 12 N 15/00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbtTHRM пРи Гкнт сссР

1 (21} 4394643/30-13 (22) 18 ° 03.88 (46) 30.12.89. Бюл. Н 48 (71) Научно-исследовательский институт медицинской энзимологии АМН СССР и Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (72) С.С. Дебов, А.С. Карягина, В.Г. Лунин, Н.Г. Лопатина, И.M. Грубер, В.M. Поляченко и И.И. Никольская-Сакович (53) 575.224.2(088.8) .(56) Карягина А.С., Лунин В.Т,, Грубер И.М. и др. Активность рестриктирующей эндонуклеазы Sso II в штаммах Escherichiacoli, трансформированных плазмидами $Ьдде11а Sonnei

47. — Молек. генетика, 198?, Ф 12, с. 26-29.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к генной инженерии.

Целью изобретения .является полу,чение штамма, продуцирующего только метилазу Язо II, без сопутствующей рестриктазы, а также увеличение уровня синтеза метилазы Sso II в клетках бактерий.

Сущность изобретения состоит в том, что получена рекомбинантная плазмидная ДНК, обуславливающая синтез метилазы Sso II,è штамм, содержащий эту рекомбинантную ДНК - продуцент метилазы Sso II.

2 (54} РЕКОИБИНАНТНАЯ ПЛАЗИИДНАЯ ДНК

33, КОДИР НАН mTHJIASW Sso

И ШТАММ BAKTEPHA ESCHERICHIA COLI

ПРОДУЦЕНТ МЕТИИАЗЫ Ssî II (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК. обусловливающую синтез метилазы Sso II. u штамм, содержащий эту рекомбинантную

ДНК вЂ” продуцент метилазы Sso II. Целью изобретения является получение штамма, продуцирующего только метилазу Sso II без сопуствующей рестриктазы, а также увеличение уровня синтеза метилазы Sso II в клетках бакте- Я рий. Получен штамм, продуцирующий только метилазу Sso II без рестриктазы, и повышен уровень синтеза метилазы Sso II в клетках бактерий в 40 раз по сравнению с используемым ранее. 2 с.п. ф-лы.

Полученная плазмида и 33 состоит из следующих элементов: плазмидная

ДНК вектора pUC19, размер которой

2,69 т.п.о., плазмидная ДНК Р4 из

S. sonnei 47, кодирующая метилазу

Sso II, размер которой 4,4 т.п.о.

Способ конструирования плазмиды заключается в том, что плазмидную

ДНК вектора РНС19 гидролизуют эндонуклеазой рестрикции BamHI и соединяют ДНК-лигазой с плаэмидной ДНК Р4» гидролизованной рестриктазой Hgl ХХ.

Затем смесь соединенных фрагментов

ДНК обрабатывают рестриктаэой Bam НХ и трансформируют в клетки Е. Coli

1532585

P 200. Трансформанты высевают на сред с ампициллином и из выросших клонов в щеляют плазмиду, обозначенную как

d 33.

Используют штамм бактерий E, coli

834 (r>, т ), несущий плазмиду d 33 продуцируют метилазу Ss î II ..

Штамм-продуцент метилазы Бзо 11 олучен трансформацией клеток Е. coli 10

834 плазмидой d ЗЗ. Содержание метилазы .so II в сконструированном штамме авно 300000 ед. на 1 r биомассы клеок, Пример ° . Получение плазмиды 15

33. Плазмидную ДНК из штамма соli XS13, содержащую две азмиды: Р4 (2,8 МД) и Р9 (100 МД), ыделяют щелочным методом. ПпазмидДНК Р4 отделяют от высокомоле- 20 улярной ДНК Р9 с помощью хроматорафии на ДЕАЕ-целлюлозе. Качество азделения плазмид анализируют элетрофорезом. В очищенных препаратах азмидной ДНК Р4 присутствие нлаз- 25 иды Р9 не выявляется.

Плазмидную ДНК Р4 и ДНК вектора

UC19 используют для конструирования азмиды d 33, которое проводят слеующим образом; 0,5 мкг вектора pU

1,9 инкубируют с эндонуклеазой рестикции Ватп HI (5 ед.) в буфере А

109 мМ NaC1> 50 мМ трис-НС1, рН ,5, 10 мМ MgCl <, 1 мМ дитиотрейтол). мкг плазмидной ДНК .Р4 инкубируют рестриктазой Bgl II (10 ед.) в буере 10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ

Сl, 1 мМ дитиотрейтол. Инкубацию роводят при 37 С в течение 1 ч. атем пробы нрогревают в течение 40

5 мин при 65 С и анализируют полногидролиза с помощью электрофореза.

Соединение ДНК плазмиды и вектора роводят в буфере, содержащем 0,05 М рис-НС1, рН 7,4, 0,01 M MgClg, 0,01 М 45, итиотрейтол, 0,1 MM АТФ. ДНК-лигазу » ага Т4 (100 ед/мл) добавляют из асчета 0,5 мкл фермента на 5 мкг ДНК. робу инкубируют f2 ч при fO С.

Затем в смесь соединенных фрагмен- 50 гов добавляют 1 мкг 0,5 М ЭДТА, экс1рагируют равным объемом хлороформа, переосаждают 2,5 объемами этанола,nojcae растворения осадка ДНК пробу ин убируют 12 мин при 65 С и обрабаты- - -, вают 10 ед. рестриктазы BamH1 в буфеIpe А в течение 1 ч при 37 С с целью обогащения смеси соединенных фраг ментов гибридными молекулами ДНК.

Полученной смесью трансформируют клетки Е. coli pS 200, для чего

50 мкл суспензии Е. coli PS 200 вно-. сят в 20 мл питательного бульона LB выращивают до титра 7х10 кл/мл при

37 С во флаконе объемом 200 мп. После чего суспензию клеток охлаждают во льду в течение 1.0 с и центрифугируют при 5000 g 15 мин при 4 С. Супернатант сливают. Осадок . ..ñïåíäèðóþò в

1/2 объема 0,1 М CaC1„ После 40 мин инкубации во льду клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют осадок в 0,5 мл 0,1 М СаС1 . Суспензию клеток выдерживают во льду 1012 ч, затем используют для трансформации.

К 200 мкл суспензии клеток в СаС1 добавляют 20 мкл смеси соединенных фрагментов ДНК и выдерживают 40 мин во льду, затем на 90 с помещают в ледяную баню с температурой 42 С, после чего еще на 2 мин в лед. Суспензию разводят в 10 раз бульоном

LB и инкубируют 1 ч при 37 С, после чего высевают на чашки с ампициллином (50 мкг/мп). Из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК. обозначенную как d ЗЗ, ": î,äåðæàùóþ в своем составе вектор pUC19, несущий ген

Bla который детерминирует синтез р-лактамазы и плазмидную ДНК Р4, несущую ген метилазы Бзо II, определяющий синтез метилазы Sso II. Сайт узнавания рестриктазы Bgl II лежит . внутри последовательности гена рестриктазы Sso II поэтому при клонировании происходит встраивание внутрь гена рестриктазы ДНК вектора pUC19, разобщающей этот ген, и синтеза рестриктазы Язо II в клетках, несущих плазмиду с1 33, не происходит.

Плазмидную ДНК d 33 подвергают рестрикционному анализу.

Характеристика штамма.

Плазмиду d 33 трансформируют в штамм E. coli B834 по методу, описанному в примере, получают штаммпродуцент метилазы Sso II. с активностью не менее 300000 ед/г биомассы клеток.

Штамм Es cherichia coli Â834, несущий плазмиду d 33 (r, т ) — продуцент метилазы Sso II характеризуется следующими признаками.

Культурально-формологические признаки.

2585 6

E. coli, трансформированных плазмидой d 33.

Штамм т

5 153

Клетки прямые, палочковидные, неподвижные, грамотрицательные, лактозопозитивные. При рассеве на чашки с 1,3%-ным МПА рост в виде отдельных . колонии, иногда в R-форме с неровными

5 краями. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах (МПА, ИЛБ, LB-бульон и LB-агар).

Физиолого-биохимические признаки. с

Клетки растут в пределах 4-45 С при оптимуме рН 6,8-7,5. Штамм разлагает глюкозу, лактозу, маннит с образованием кислоты, не разлагает сахарозу, сбраживает мальтозу, ксилоэу, сорбит, дульцит, рамнозу, образует индол и сероводород.

Проявляет устойчивость к ампициллину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды d 33.

Уровень синтеза метилазы анализируют следующим образом.

Культуру клеток E.coli В834, несущих плазмиду d 33, выращивают в

1 л среды Т.В с 50 мкг/мл ампициллина при 37 С до титра 4 х 10 кл/мл.

Клетки осаждают центрифугированием (5000 я, 15 мин). 1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера, содержащего 50 мМ трис-НС1, рН 7,6, 0,1 М

NaCl, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 100 мкг/мл лизоцима и выдерживают при

0 С 10 мин. Клетки разрушают ультрао звуком. Экстракт получают центрифугированием при 2 С (48000 g) в течение часа.

Активность метилазы Sso II определяют в реакционной смеси с общим объемом 100 мкл, содержащей 1 мкг акцепторной ДНК, 0,5 мк Ки Н S-аденозилметионина и 5 мкл каждого из десятикратных разведений супернатанта. Инкуба- цию проводят в течение различных временных промежутков от 1 до 24 ч при

37 С. Пробы наносят на фильтры СР/С, осаждают 5%-ной трихлоруксусной кислотой, отмывают 70%-ным этанолом, высушивают и просчитывают радиоактивность в толуоловом сцинтилляторе. 3а единицу ферментативной активности принимают количество фермента, обеспечивающего полную модификацию 1 мкг акцепторной ДНК за 24 ч.

Уровень активности метилазы, определенный в штамме Е. coli В834, несущем d 33, соответствует 300000 ед. на 1 кг биосмассы.

Ниже приведены значения уровней синтеза метилазы Sso II в штаммах

Активност метилазы, ед/г

E.coli PS 200/d33 10000

E. co 1 i В834/d 33 300000

Рекомбинантная плазмида Й 33 представляет собой высококопийную, имеющую удобный селективный маркер, векторную молекулу, несущую ген метилазы

Sso II..Ëëàsì ùa d 33 может служить основной для проведения работ, имеющих теоретическое значение — для изучения характера метилирования Sso II и определения первичной структуры гена метилазы, а также для практических работ по созданию суперпродуцентов метилазы Sso II.

Штамм бактерий Escherichia соИ

В834, трансформированный плазмидой

d 33, является эффективным продуцентом метилазы Sso II (уровень активности метилазы — 300000 ед. на 1 г биомассы). При этом в штамме. E.coli

В834 не продуцируется рестриктаза

Sso ЕЕ. сопутствующая метилазе Sso II близкая по физико-химическим параметрам к белку метилазы Sso II. Этот факт позволяет при работе с этим штаммом использовать наиболее легкую технологически схему очистки метилазы Sso II.

1 !

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК

d 33, кодирующая метипазу Sso II, молекулярной массой 4,5 ИЛ и размером

7, 1 т.п.о., содержащая плазмидную

ДНК вектора PU С19 размером 2,7 т.п.а плазмидную ДНК Р4 с геном метилазы

Sso II размером 4,4 т.п.о один участок разщепления зндонуклеазами Cla I, EcoR V, Sac II, Pst I, Sph I, Hind III, S ас I, Kpn I, Sma I. ХЬа I, участка расщепления Cfr 101, SalG I, четыре участка расщепления EcoR I, В1а ген, кодирующий р -лактамазу,фрагменты re« на lac, соединенные с синтетическим полнлинкером, расположенные по обе стороны клонированной ДНК Р4, ген метилазы Sso II, расположенный на клонированной ДНК плазмиды Р4, детерминирующей синтез метилазы Sso II, последовательность гена рестриктазы Sso.ЕЕ; состоящую из двух фрагментов, расположенных по обе стороны ДНК вектора

1532585

Составитель Е. Кузнецова

РЬдактоР T. Лазоренко ТехРед JI ° Cåð æoâà Корректор Н. Король

Заказ 8070/36 Тираж 501 Подписное

В ШПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб;, д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

PU сп зы

С19, которая, таким образом, ие собна определять синтез рестриктаSso II.

2. Штамм бактерий Escherichia coli

ГИСК, В834 — продуцент:метилазы Sso II.